初心者のためのdPCR

 dPCRの進化

今日の研究における複雑な問いに取り組むには、従来のPCR技術の能力を超えたより深い情報を必要とします。第三世代のデジタルPCRは、そのギャップを埋め、日々の研究における問いに取り組むためにますますシンプルで、そして実用的な技術となっています。

デジタルPCR技術の概念は、 Sykesらが「限界希釈PCR」として説明した1992年より存在しています。この一般的な方法は、エンドポイント解析とポアソン分布統計を用いて、サンプル内に存在する核酸分子の絶対数を定量するものです。その後、1999年にVogelsteinとKinzlerが革新的な研究を開発し、サンプルをパーティションと呼ばれる個別の反応液に希釈、分配し、増幅後に蛍光シグナルを示す単一の生産物を検出および解析する方法を発表しました。その後、彼らは、今日私たちの誰もが知っている「デジタルPCR」という用語を造り出しました。

長年にわたり、これらの方法は改良を重ね、商品化されて、より広く採用されるようになっています。マイクロ流体チップ、ディスク、マイクロアレイ、マイクロドロップレット、または油と水エマルションに基づくドロップレットクリスタル上で、さらに最近ではqPCR状のプレートでデジタルPCRを実行できます。

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デジタルPCRは、標準曲線を参照する必要なく、核酸の絶対定量を可能にします。サンプルを何千という反応区画に分割するメソッドは阻害物質に対する高い耐性、優れた精度、向上した感度、高い再現性を示します。これらの特徴のためにデジタルPCR をコピー数多型解析、稀な突然変異の検出、ウイルス負荷の検出、遺伝子発現解析、次世代シークエンシングライブラリ定量をはじめとするさまざまな応用に使用する研究者が増えています。

分割統治

サンプルはqPCRの場合と同様に調製する一方で、サンプルを増幅前に何千という個々の反応区画に分割するサンプルパーティショニングは、デジタルPCRに独特のものです。分割内に分子がランダムに分布することにより、qPCRのバルク解析とは異なり、デジタルPCRは、競合する標的の影響を最小限に抑え、希少な標的を検出する精度と感度を強化します。

これにより、次のことが可能になります。

• 少量の標的または複合バックグラウンドの中の標的を定量する
• 対立遺伝子の変異体（SNP）を検出し識別する
• qPCRでは検出不可能な標的レベルのわずかな変化をモニターする

ポワソン’法でパーティショニングが解析可能になります

real-time qPCRに対して、デジタルPCR は、標的分子の相対量を決定するのに各増幅サイクルに依存せず、ポアソン分布統計に依存して、エンドポイント増幅の後、標的の絶対量を決定します。

標的分子は、利用可能なパーティションすべてにランダムに分布しているため、ポアソン分布は、パーティションあたりの分子数の平均値（ゼロ、1以上）を推定し、陽性のパーティションあたりの標的分子のコピー数を算出します。陽性反応と陰性反応の数についてのポアソン分布の統計解析で、標的配列の正確な絶対量が割り出されます。