Concernant leur recherche en biologie moléculaire et en génomique impliquant la quantification des acides nucléiques, les scientifiques se trouvent souvent à la croisée des chemins. Quelle technique de quantification choisir pour réaliser leurs objectifs de recherche avec efficacité : la PCR numérique (dPCR), plus précise et plus fiable, ou la Real-Time PCR quantitative (qPCR), plus normalisée et plus familière ? Ce choix dépend de l’application. Pour les esprits curieux, cet article donne un aperçu de l’évolution technique ainsi que des applications pratiques de ces deux générations de techniques de PCR.
Depuis sa découverte en 1993, les chercheurs apprécient la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la facilité d’utilisation de la qPCR. Cette technique est particulièrement utile pour la réalisation d’expériences d’expression génique, la détection de SNP, le génotypage ou la discrimination allélique, ainsi que pour la validation des données de biopuces. Les dosages de qPCR bien conçus peuvent détecter plusieurs copies d’une séquence cible par réaction, permettant ainsi de bénéficier d’une large gamme dynamique de quantification. Le choix du procédé chimique de détection s’étend des intercalants fluorescents (SYBR Green) aux sondes spécifiques à la cible (TaqMan, balises moléculaires, etc.)1. Le coût par échantillon est extrêmement flexible et adapté au volume réactionnel, au débit et à la méthode de détection pour satisfaire les besoins de recherche spécifiques. De surcroît, la publication des directives MIQE pour la qPCR a fait progresser la cohérence entre les laboratoires et augmenté la reproductibilité expérimentale.2
Cependant, la qPCR a montré ses limites dans les applications nécessitant une exactitude et une sensibilité supérieures, telles que la variation du nombre de copies et la détection des événements rares. Dans de telles applications, la dPCR surpasse la qPCR en permettant non seulement de mesurer le nombre de copies absolu, mais aussi de dépasser les limites de détection, c’est-à-dire de détecter les différences de moindre ampleur et les cibles de faible abondance, ou, autrement dit, de trouver une aiguille dans une botte de foin. La PCR numérique a supprimé le besoin de recourir à une courbe d’étalonnage et démontré une moindre sensibilité aux inhibiteurs en raison de la lecture de fluorescence en point final des partitions. Les taux d’erreur ont été réduits en supprimant le biais d’efficacité de la PCR, ce que la communauté scientifique a manifestement apprécié3
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Paradoxalement, bien que le début des années 1990 ait vu l’émergence de la « PCR en dilution limitée » ou « PCR numérique », sa progression a rapidement été entravée par la venue de la Real-Time PCR4,5. Pour quelles raisons ? À cause du manque d’instruments et de procédés chimiques. Heureusement, une étude plus récente dresse un tableau prometteur pour l’avenir de cette technologie6. La PCR numérique représente une approche directe, que l’on peut qualifier de « tout ou rien » et qui, combinée aux améliorations technologiques constantes et à la publication des directives MIQE, a entraîné un regain d’intérêt pour l’exploitation de son potentiel.7 De nos jours, de plus en plus de scientifiques se tournent vers la dPCR pour étudier les mutations des gènes du cancer, contrôler l’efficacité des immunothérapies, détecter les pathogènes, analyser les OGM, évaluer les fréquences d’édition génique et effectuer des tests prénataux de dépistage des maladies génétiques, étendant ainsi son champ d’application.8
2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
Depuis sa découverte en 1993, les chercheurs apprécient la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la facilité d’utilisation de la qPCR. Cette technique est particulièrement utile pour la réalisation d’expériences d’expression génique, la détection de SNP, le génotypage ou la discrimination allélique, ainsi que pour la validation des données de biopuces. Les dosages de qPCR bien conçus peuvent détecter plusieurs copies d’une séquence cible par réaction, permettant ainsi de bénéficier d’une large gamme dynamique de quantification. Le choix du procédé chimique de détection s’étend des intercalants fluorescents (SYBR Green) aux sondes spécifiques à la cible (TaqMan, balises moléculaires, etc.)1. Le coût par échantillon est extrêmement flexible et adapté au volume réactionnel, au débit et à la méthode de détection pour satisfaire les besoins de recherche spécifiques. De surcroît, la publication des directives MIQE pour la qPCR a fait progresser la cohérence entre les laboratoires et augmenté la reproductibilité expérimentale.2
Cependant, la qPCR a montré ses limites dans les applications nécessitant une exactitude et une sensibilité supérieures, telles que la variation du nombre de copies et la détection des événements rares. Dans de telles applications, la dPCR surpasse la qPCR en permettant non seulement de mesurer le nombre de copies absolu, mais aussi de dépasser les limites de détection, c’est-à-dire de détecter les différences de moindre ampleur et les cibles de faible abondance, ou, autrement dit, de trouver une aiguille dans une botte de foin. La PCR numérique a supprimé le besoin de recourir à une courbe d’étalonnage et démontré une moindre sensibilité aux inhibiteurs en raison de la lecture de fluorescence en point final des partitions. Les taux d’erreur ont été réduits en supprimant le biais d’efficacité de la PCR, ce que la communauté scientifique a manifestement apprécié3
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Paradoxalement, bien que le début des années 1990 ait vu l’émergence de la « PCR en dilution limitée » ou « PCR numérique », sa progression a rapidement été entravée par la venue de la Real-Time PCR4,5. Pour quelles raisons ? À cause du manque d’instruments et de procédés chimiques. Heureusement, une étude plus récente dresse un tableau prometteur pour l’avenir de cette technologie6. La PCR numérique représente une approche directe, que l’on peut qualifier de « tout ou rien » et qui, combinée aux améliorations technologiques constantes et à la publication des directives MIQE, a entraîné un regain d’intérêt pour l’exploitation de son potentiel.7 De nos jours, de plus en plus de scientifiques se tournent vers la dPCR pour étudier les mutations des gènes du cancer, contrôler l’efficacité des immunothérapies, détecter les pathogènes, analyser les OGM, évaluer les fréquences d’édition génique et effectuer des tests prénataux de dépistage des maladies génétiques, étendant ainsi son champ d’application.8
Perspectives
Les technologies de PCR, en temps réel et numérique, semblent promises à une expansion certaine dans le futur. Tandis que la qPCR continue d’être un élément essentiel dans les laboratoires, les avantages de la dPCR en termes de sensibilité, précision, robustesse et reproductibilité permettront aux scientifiques de repousser les limites de la connaissance. Avec la venue de la technologie de dPCR sur nanoplaques, les laboratoires qui envisagent de passer au numérique bénéficieront de gains notables en matière de débit et de multiplexage. L’industrie et la recherche universitaire ont besoin de s’adapter à cet environnement concurrentiel et de trouver un parfait équilibre dans le monde en pleine mutation de la PCR.Références
1. Deepak S.A. et al. Real-Time PCR: Revolutionizing detection and expression analysis of genes. Curr. Genom. 2007;8:234–251.2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.