La dPCR pour les débutants

Évolution de la dPCR

Les questions complexes que soulève actuellement la recherche exigent des informations d’une précision que les technologies de PCR classiques sont incapables de fournir. La PCR digitale de troisième génération résout ce problème, elle devient une technique plus simple et plus pratique qui permet de répondre aux questions de la recherche au quotidien.

Le concept de la technique de PCR digitale remonte à peu près à 1992, lorsque Sykes et al. l’ont décrite comme une « PCR à dilution limitative ». Cette méthode générale utilisait l’analyse en point final et la loi de Poisson pour quantifier le nombre absolu de molécules d’acide nucléique dans un échantillon. Vogelstein et Kinzler ont ensuite révolutionné la discipline en 1999 : ils ont développé une méthode consistant à diluer et répartir l’échantillon en réactions individuelles appelées fractions, puis des produits individuels avec signaux de fluorescence sont détectés et analysés après amplification. Ils ont alors inventé le terme « PCR digitale », que nous connaissons tous aujourd’hui.

Avec les années, ces méthodes ont été perfectionnées et commercialisées pour être adoptées par le plus grand nombre. Nous pouvons utiliser la PCR digitale sur des puces ou disques microfluidiques, des puces à ADN et des micro-gouttelettes ou des cristaux de gouttes issus d’émulsions d’huile et d’eau et, depuis peu, sur des plaques de type qPCR.

Vous cherchez toujours des réponses sur ce qu’est la PCR digitale ? Consultez notre guide de laboratoire pour en savoir plus sur les principes fondamentaux, les avantages, les limites et les applications de la PCR digitale.

La PCR digitale permet une quantification absolue des acides nucléiques sans avoir recours à des références ou à des courbes d’étalonnage. La méthode, qui divise l’échantillon en milliers de réactions individuelles, présente une grande tolérance aux inhibiteurs, une précision supérieure, une sensibilité accrue et une grande reproductibilité. En raison de ces fonctionnalités, de plus en plus de chercheurs appliquent la PCR digitale dans leur analyse de variation du nombre de copies, la détection de mutations rares, la détection de la charge virale, l’analyse de l’expression génique, la quantification de la banque de séquençage à haut débit et autres applications.

Diviser pour mieux régner

Tandis que l’échantillon est préparé ainsi pour la qPCR, le fractionnement d’échantillon, dans lequel un échantillon est divisé en milliers de réactions individuelles avant amplification, est propre à la PCR digitale. En répartissant aléatoirement les molécules dans les fractions, contrairement à l’analyse globale en qPCR, la PCR digitale limite les effets des cibles concurrentes et améliore la précision et la sensibilité de la détection des événements rares.

Elle permet aux chercheurs de :

• Quantifier les cibles peu abondantes ou les cibles sur un fond complexe
• Détecter et distinguer les variants alléliques (SNP)
• Surveiller les changements de moindre ampleur dans les niveaux de cibles, qui sont indétectables par qPCR

La loi de Poisson donne tout son sens au fractionnement

Contrairement à la qPCR en temps réel, la PCR digitale ne dépend pas de chaque cycle d’amplification pour déterminer la quantité relative de molécules cibles, elle se base plutôt sur la loi de Poisson pour déterminer la quantité cible absolue après une amplification en point final.

La molécule cible étant distribuée de manière aléatoire dans toutes les fractions disponibles, la distribution de Poisson estime le nombre moyen de molécules par fraction (zéro, une ou plusieurs) et calcule les copies de la molécule cible par partition positive. L’analyse statistique de Poisson du nombre de réactions positives et négatives permet une quantification précise et absolue de la séquence cible.