Todo sobre el ARN: amplificar, secuenciar, ligar, marcar
Detectar y manipular el ARN mediante la amplificación
Las transcriptasas inversas son enzimas capaces de polimerizar una hebra de ADN (ADNc) que sea complementaria a un molde original de ARN. El ARN se puede degradar por la acción de las RNasas y el uso de una enzima de transcriptasa inversa para producir ADNc resuelve los problemas de trabajar con ARNm. El ADNc se convierte en el molde estable en una variedad de aplicaciones anterógradas para los estudios de ARN, como el análisis de la expresión genética. Se pueden utilizar una PCR normal, una qPCR, una RT qPCR en un solo paso o métodos isotérmicos para amplificar el molde de ADNc. Tras la amplificación, se puede realizar una clonación con protocolos convencionales de enzimas o una clonación independiente de la ligadura utilizando la actividad de exonucleasa de 3’→ 5’ de la T4 DNA Polymerase.
Todas las enzimas de transcriptasa inversa (ADN polimerasas dependientes de ARN) se pueden utilizar para:
Transcriptasas inversas
Elija una enzima de transcriptasa inversa o un kit de acuerdo con los requisitos de su molde de ARN o aplicación.
ARN polimerasas y ligasas
Las ARN polimerasas o, más concretamente, las ARN polimerasas dirigidas por ADN, son enzimas que sintetizan el ARN a partir de un molde de ADN. La enzima polimerasa poli(A) utiliza ARN monocatenario como primer para añadir una cola de poli(A) al ARN catalizando la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ de ARN.
Las ARN ligasas T4 son enzimas útiles para los análisis de RNA, en particular previos a procedimientos como la secuenciación de ARN de alto rendimiento y las micromatrices. Las T4 RNA Ligase 1 y 2 son enzimas que pueden marcar, circularizar o llevar a cabo una ligadura intermolecular de ARN uniendo polinucleótidos adyacentes 3’-OH y 5’- PO4. La unión de los adaptadores a los extremos 3' de ARN con T4 RNA ligase 1 es un primer paso útil para la cuantificación y el descubrimiento de ARN mediante RT-PCR y secuenciación de alto rendimiento.
La manipulación del ARN es sencilla con estas polimerasas y ligasas.
Digestión y protección de ARN
El ensayo de protección de ribonucleasas (ribonuclease protection assay, RPA) con la enzima RNase A es un técnica utilizada para determinar la abundancia relativa o absoluta del transcrito y para identificar los extremos del ARNm y los límites entre intrones y exones.
Las sustituciones de una única base se pueden detectar y localizar mediante un sencillo método enzimático que implica la escisión de la RNase A de las discordancias en los heterodúplex de ARN:ADN.
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Preguntas frecuentes acerca de los análisis de ARN
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