Scientist analyzing dPCR results on dPCR system
数字 PCR

dPCR assay 开发和故障排查

数字 PCR 实验流程 — 概述

数字 PCR (dPCR) assay 开发取决于多种因素,包括模板、仪器、应用以及实验目的。大多数数字 PCR 实验流程包括下列步骤并加以变化:

样本制备是实现 PCR 高效扩增的关键步骤。准备数字 PCR 起始模板时,需要考虑几个重要参数。

这些参数包括:

  • 样本纯度
  • 样本结构完整性
  • 样本长度和序列
  • 样本投入量
  • 样本重复
  • 对照

下面将讨论如何优化这些因素以实现更好的 dPCR 运行。

Pipetting as the first step of sample preparation in a dPCR protocol

样本纯度

由于 PCR 依赖于多轮酶促反应,与单步酶促反应相比,其对蛋白质、酚/氯仿、盐和 EDTA 等杂质更为敏感。核酸模板的纯度对 dPCR 而言非常重要,因为污染物会干扰荧光检测。

  • 醇类(乙醇、异丙醇)和盐会影响引物和探针的退火性能、降低扩增效率(如降低阳性荧光信号)以及阻碍阳性和阴性反应分区的区分
  • 腐殖酸会淬灭 dsDNA 结合染料(如 EvaGreen)的荧光
  • 核酸酶会降解 RNA 和 DNA
  • 尿素和苯酚会使 Taq 聚合酶变性
  • 酸性多糖会模拟核酸并与 Taq 聚合酶形成末端复合物

尽管与 qPCR 相比,dPCR 对抑制剂耐受度更强,但使用高纯度模板的效果更佳。根据模板的不同,有多种试剂盒(如基因组 DNA、质粒 DNA、总 RNA 等)可实现高核酸纯度和 PCR 效率。

样本完整性:长度和序列

扩增子长度和序列与模板纯度一样影响 dPCR 实验的成功。降解严重的 RNA 和 DNA 模板,往往 OD 值定量的 DNA 数量与 dPCR 扩增和检测到的拷贝数之间存在差异。实现期望的灵敏度(如突变检测),可能需要高于预期的 DNA 数量。建议保持扩增子尽可能短,特别是当使用降解严重的样本时(FFPE DNA、cfDNA)。

同样,残留的交联可以阻止链分离和扩增,无碱基位点可以诱导非特异性扩增。可使用从 FFPE 样品中回收高质量 gDNA 的专用试剂盒和方案。

样本完整性:结构

模板随机微分化对 dPCR 的准确定量至关重要。大多数模板 DNA 都能观察到均匀分布的 PCR 信号,包括福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) DNA、循环游离 DNA (cfDNA)、互补 DNA (cDNA) 和 gBlock。

为实现复杂结构的高分子量模板的均匀分布,建议使用限制性酶切等策略。

dPCR

以下情况,建议在数字 PCR 检测之前使用限制性酶切:

  • 高黏度溶液 – 高黏度可能会降低检测的准确性,尤其是在较小的体积中使用较大量 DNA 时。使用限制性酶切降低黏度,可在 dPCR 实验流程中使用更高的 DNA 浓度 (1 µg)。
  • 连锁或串联基因拷贝 – 如果一个阳性反应分区包含多个拷贝,则连锁的拷贝将被计为一个拷贝。可以通过使用限制性酶切来物理分离基因拷贝,以独立分离至反应分区来克服这个问题。
  • 超螺旋质粒 – 建议使用限制性酶切使质粒 DNA 线性化,并提高引物/探针与 DNA 结合的可及性和效率。这会提高质粒定量的准确度。
  • 长片段 DNA 分子 (>30 kb) – 长片段 DNA 分子可能会被不均匀地微分化,进而导致模板浓度过度定量。限制性酶切有助于将长片段模板切割为短片段,从而实现均匀分布和更准确定量。
重要提示
当选择限制性酶时,酶不应在扩增子序列本身内部产生切割。

样本投入量

样本投入量取决于所使用的 dPCR 技术。在 QIAcuity 纳米微孔板数字 PCR 中,26k 纳米微孔板每个反应最多可投入 217,000 个拷贝,8.5k 纳米微孔板每个反应最多可投入 170,000 个拷贝。

如何计算拷贝数

如果生物体的单倍基因组大小是已知的,可通过使用下列方程式计算出基因组 DNA (gDNA) 输入质量与获得的拷贝数(对于单拷贝基因)之间的相关性:

基因组大小 (bp) x 单个碱基对的平均重量 (1.096 x 10–21 g/bp) 

例如,对于基因组大小约为 3.3 x 109 bp 的人类基因组,计算如下:

3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
下表显示了几种模式生物 10 ng gDNA 的拷贝数
生物体 基因组大小 10 ng gDNA 基因拷贝数(1 个拷贝/单倍体基因组)
人类 3.3x109 3000
斑马鱼 1.7x109 5400
Saccharomyces cerevisiae 1.2x107 760,500
Escherichia coli 4.6x106 2,000,000
标准质粒 DNA 3.5x103 2,600,000,000

重要提示
在 dPCR 中,每个反应分区的平均拷贝数不应超过 5 个。理想情况下,它应该在 0.5-3 之间。

样本重复

建议对样本进行一式两份或一式三份分析,以防止因移液误差导致的定量偏差。复孔数据相加会增加检测事件数量。这有助于提高数字 PCR 检测的精确度。

对照

  • 阴性对照 – 需要监测假阳性反应,可能是污染或引物和探针的问题引起的。阴性对照也被用于确定检测限 (LOD)。
  • 阳性对照 – 用于测试在设定的反应条件下模板是否会发生扩增
  • 无模板对照 (NTC) – 质控所有试剂中的污染
QIAcuity 系统上的数字 PCR:简介
该网络研讨会涵盖了 QIAcuity 仪器上数字 PCR 的各种基本知识,并强调模板的选择及其浓度。

DNA 结合染料

嵌合荧光染料,如 EvaGreen,可结合所有双链DNA分子,并在结合后发出特定波长的荧光信号。由于 PCR 产物的积累,信号强度随着循环次数的增加而增加。使用 DNA 结合染料,如 EvaGreen,可分析多种不同的靶标,而不需要合成靶标特异性标记的探针。然而,非特异性 PCR 产物和引物二聚体也可能产生荧光信号,甚至在数字 PCR 数据分析过程中作为单独的荧光信号簇出现。如使用 EvaGreen ,PCR 的高特异性至关重要。 

Fluorescence detection using DNA intercalating dyes in digital PCR
Fluorescence detection using primers/probes in digital PCR

水解探针

水解探针又称 TaqMan 探针,是具有结合荧光基团和猝灭基团的序列特异性寡核苷酸。荧光基团与探针的 5' 端结合,淬灭基团与探针的 3' 端或内部相应序列结合。在 PCR 延伸阶段,Taq DNA 聚合酶的 5′→3′ 核酸外切酶活性将探针水解酶切,使荧光基团和淬灭基团分离。因此,可以检测到与累积的 PCR 产物数量成比例的荧光信号。

作为 dPCR 故障排查提示,您应该避免某些荧光基团和淬灭基团组合。例如,如果淬灭基团的发射与荧光基团的发射重叠,则会在相应的荧光通道内产生额外的背景信号。这种背景噪音会对聚类分离和峰值分辨造成不利影响。 

有效的引物和探针设计对成功的数字 PCR 检测至关重要。dPCR 方案中引物和探针设计遵循与 qPCR assay 相同的规则。引物和探针设计要点包括:

  • 靶标匹配
  • 碱基组成
  • 扩增子长度
  • 解链温度
  • 无二级结构
  • 无自身互补和相互互补(自退火)
  • 无交叉反应
Optimizing primer design and probe design for digital PCR assays
数字 PCR实验流程中,引物和探针浓度往往略高于 qPCR。更高的引物和探针浓度会增加荧光强度/振幅,从而能够更好地分离背景噪音与特定信号。最终能够实现更准确的靶标定量。数据表明,每个反应引物组的终浓度在 0.5 µM – 0.9 µM 之间,探针的终浓度为 0.25 µM 时,可获得最佳结果。

引物和探针的存储

除了谨慎的 assay 设计以及恰当浓度外,引物和探针的正确存储对 dPCR 的成功也至关重要。

冻干的引物和探针应溶解在少量低盐缓冲液中,如 100 µM TE 缓冲液 (10 mM Tris·Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0),以获得浓缩储存液。作为例外,Cy5 和 Cy5.5 荧光基团标记的探针应储存在 pH 7.0 的 TE 缓冲液中,因为它们在较高的 pH 下会发生降解。

引物存储时,小等份溶于无核酸酶 TE 缓冲液中可在 -20°C 保存至少 1 年。荧光标记的探针在相同的条件下可稳定 6 至 9 个月。应避免反复冻融,降低降解风险。

对于 dPCR 多重检测引物-探针组合,可使用 20x 引物-探针混合物,在建议浓度下针对特定靶标有 2 个引物和 1 个探针。

溶解引物和探针,应将含有冻干引物或探针的试管轻轻离心,以收集管底部的所有物质。加入所需体积的无菌无核酸酶 TE 缓冲液,混匀后静置 20 分钟,使引物或探针完全溶解。引物或探针溶液应再次混合,并用分光光度法测定浓度。dPCR 故障排查提示避免将引物和探针溶解在水中。其中一些引物和探针在水中的溶解度和稳定性比在 TE 缓冲液中低。 

A representation of the nanoplate dPCR workflow

标准纳米微孔板 dPCR 工作流程中有三个主要步骤:样本加载、扩增和数据分析。

在优化 dPCR 反应步骤时,产生高质量 qPCR 结果的 qPCR 条件通常可以直接应用于 dPCR。然而,推荐核对制造商对具体要求的建议。 

样本加载技巧

三个步骤的第一步是制备和加载样本。在 PCR 混合物制备和加载纳米微孔板的过程中,可以参考以下建议:

  • 清洁工作场所和实验室器具,以降低外来 DNA 污染风险
  • 为确保最高的 PCR 效率,在进行主要数字 PCR 检测之前,可对不同稀释度样本进行测试
  • 在反应混合物制备之前,请解冻所有组分并充分混匀以获得均匀的溶液,短暂离心以避免溢出。
  • 将预混液与样本、引物、无 RNAase 水以及限制性酶(如果使用)混合
  • 使用无菌移液器吸头
  • 使用移液器将反应混合物移入纳米微孔板内。确保在样本转移和微孔板下游运送过程中,没有气泡被引入到板孔中
  • 为防止蒸发和污染,请使用封板滚轮和封膜小心地密封纳米微孔板
  • 将纳米微孔板放入 dPCR 仪器时,只需握住微孔板的侧边缘,避免摇晃或转动,以确保 dPCR 反应混合物停留在输入孔的底部
  • 设置软件并启动 dPCR 运行

扩增技巧

三个步骤的第二步是运行 dPCR 程序。在该步中,每个孔中的反应混合物被微分化为成千上万个反应单元。在热循环模块上进行 PCR 反应。如果反应分区内存在靶标模板,则在成像期间可检测到阳性荧光信号。图像由专用软件进行处理。 通过dPCR 仪器本身或使用连接的软件,可监测当前的微孔板状态。

获得最佳扩增和 PCR 效率的技巧包括:

  • 退火温度 – 影响 dPCR assay 的特异性,通常设置为 55°C 和 65°C 之间,当阳性和阴性反应分区达到最大分离时为最佳的退火温度;提高退火温度有利于改善阳性信号与背景噪音间的分离
  • 扩增循环 – 建议运行 40 个扩增循环,以实现阳性信号与背景噪声之间的充分分离。在一些情况下,可能必须提高热循环数量,以实现优异的性能

三个步骤的最后一步,使用基于泊松分布统计公式的绝对定量进行数字 PCR 数据分析。

QIAcuity Software Suite 可以根据具体的应用目的进行数字 PCR 数据分析:绝对定量、突变检测、基因组编辑、拷贝数变异或基因表达。在绝对定量分析(一级分析)中,该软件生成浓度图以及所选板孔阳性和阴性反应分区视图。热图视图可并列显示靶标通道和参比通道。直方图和散点图可用于更改阈值设置和重新计算结果。在 QIAcuity Software Suite 中,您可以创建关于微孔板分析结果的报告。绝对定量是所有后续计算和二级分析(如突变检测分析、基因表达分析、拷贝数变异分析等)的先决条件。

数字 PCR 数据分析技巧: 

  • 将阳性和阴性反应分区的分类阈值设置为略高于阴性反应分区簇
  • 使用仅具有阴性反应分区的 NTC 样本来协助设置阈值,同时也可对所有板孔进行检查
  • 您可以将单个孔的荧光振幅设置为略高于或低于 NTC,以避免某些反应分区的错误分类
  • 尽管不存在共识值,但当阳性反应分区数超过 2 个时,反应通常被认为是阳性
  • 为解决孔与孔之间和批次与批次之间的差异,可使用体积精度因子 (VPF) 来定义每个孔的确切体积,并通过软件应用该因子进行浓度计算
数字 PCR 数据示例
QIAcuity 数字 PCR 应用指南
查找 dPCR 应用实验设置和执行数据分析的深入信息。

数字 MIQE ( dMIQE) 指南

制定数字 PCR 实验的出版所需最少信息 (Minimum Information for Publication of Digital PCR Experiments, dMIQE) 指南是为了确保 qPCR 结果的重复性和可比性而创建的,现在也适用于数字 PCR 方案。 这套指南用于 dPCR 数据的生产和发布,目的是协调 dPCR 方法并提供可以在不同实验室之间轻松解读的有意义结果。

dMIQE 指南提供了一份用于发表 dPCR 实验结果的条目清单,以便实验方法和结果可以被重复、遵循和理解。无论使用哪种 dPCR 技术,dMIQE 指南均可用于促进实验的重复性,并为分析和审查工作的技术质量提供关键信息。 

Researchers optimizing dPCR assays and remaining compliant with dMIQE guidelines

dMIQE 指南清单中的条目被认为是发表 dPCR 结果时必须报告的内容。需要报告的信息包括但不限于:

  • 每个反应分区的平均 DNA 靶标拷贝数 (λ)
  • 反应分区数(与平均 DNA 靶标拷贝数一起,这些值可以确定 dPCR 检测的精确度)
  • 模板结构信息,因为样本的性质可能会影响数据的准确性和可靠性:
    • 单个反应分区模板类型:基因组、质粒等。
    • 来源:生物体、组织、细胞、食物、植物等。
    • 处理:限制性酶切、超声处理、预扩增、稀释、无
  • 单个反应分区体积,该体积因 dPCR 平台而异
  • 反应总体积,可通过反应分区数量乘以反应分区体积来计算
  • 所用的对照品类型
  • 阳性和阴性实验数据的代表性扩增图或终点荧光值
  • 实验方差示例,最好来自多个生物重复,以便更准确地捕捉实验的不确定性
  • 其他
白皮书:理解和克服死体积
死体积是 dMIQE 指南中的一个重要参数。了解更多关于如何克服死体积限制以实现更高 dPCR 灵敏度的信息。 

如何实现 qPCR 到 dPCR 的优化转移

real-time PCR assay 设计的参考因素也适用于数字 PCR 实验流程。能够产生令人满意的 qPCR 结果的 assay 同样会在 dPCR 中获得成功。建议在最初使用经过验证的 qPCR 方法,但如果阳性反应分区的终点荧光值需要改进,则可尝试引物/探针浓度梯度。如以上所述,还应注意荧光基团的兼容性以及 dPCR 建议的热循环条件和引物/探针浓度。
dPCR assay 优化参数
条件 变量对下列因素的影响 范围
退火温度 •特异性
•阳性和阴性反应分区的分离
•Assay 人工产品
•理论或工作 Ta +/– 2.5ºC
引物/探针浓度 •阳性和阴性反应分区的分离
(增加阳性信号或减少阴性信号)
•0.8 µm 引物;0.4 µm 探针(起点)
热循环步骤 •移除中间反应分区信号 •2 次或 3 次(包括 72ºC 延伸)
热循环重复次数 •移除中间反应分区信号 •30–60 次重复

然而,当使用一组新的 assay 时,建议进行初步试验测试来评估其性能。建议在适当的背景基质中使用特征良好且具有代表性的对照品。如果性能欠佳,则应优化 assay 以确保分析准确性。在这种情况下,报告优化过程的细节对重复性至关重要。

为了快速优化性能欠佳的 assay 方案,可在退火步骤运行温度梯度,QIAcuity 预混液也可在任何 qPCR 仪器上使用。

白皮书:qPCR 与 dPCR 的精确度和灵敏度对比
探索比较 qPCR 和 dPCR 性能的数据,以确定哪种方法适合您的应用。

数字 PCR 故障排查

dPCR 实验可能受到与 qPCR 或常规 PCR 类似问题的影响。然而,在进行数字 PCR 检测时可能会出现一些特定的挑战。下表作为典型 dPCR 方案中常见问题的 dPCR 故障排查指南,概述了可能的原因和我们的专家建议。

问题 可能的原因 我们的建议
没有阴性反应分区 如果 NTC 孔有阴性反应分区:
样本靶标浓度过高
进行梯度稀释以确定 DNA 的最佳投入量
如果 NTC 孔只有阳性反应分区:
探针存储液长期不良储存
或聚合酶过早剪切探针
而导致探针水解
重新订购探针并制备新的探针储备液,或识别
assay 内相互作用,重新设计 dPCR assay 组分,
以减少结合和剪切
没有阳性反应分区 限制性酶可能在靶标序列
内部切割
针对使用不同限制性酶进行酶切的 DNA 和未酶切的 DNA 对 dPCR assay 进行测试
靶标序列是二级结构的一部分,
或包含环、重复、高 G/C
含量
重新设计另一个靶标使用限制性酶将输入的 DNA 切割为片段
(不切割靶标序列本身)
扩增条件欠佳 执行退火/延伸温度梯度,以确定数字 PCR 方案
的最佳温度;调整物理参数(延伸时间、
等)
dPCR 部分抑制 更换核酸纯化方法/试剂盒;考虑添加
辅助剂,如 BSA
引物或探针与预期靶标
区域不匹配
确保在 dPCR assay 设计或引物/探针合成过程中
没有出现错误
NTC 孔出现阳性信号 试剂中存在模板/扩增子
污染
使用 5%–10% 漂白剂擦拭移液器、吸头盒和工作台面;
在单独的房间中制备样本并进行 dPCR;
穿戴适当的个人防护装备;含有 dUTP 的混合物
与热不稳定尿嘧啶 N-糖基化酶 (UNG)
一起使用可以减少因污染性 PCR 产物而产生的
假阳性数量,但对源自模板的污染物没有作用
阳性数量较少 DNA 纯化不理想 仅使用经过纯化的 DNA;尝试替代方法/纯化试剂盒
样本或纳米微孔板加载不当 样本 DNA 加载量不要过多或过少;小心移液,
确保全部 dPCR 混合物都已转移至纳米微孔板;
确保样本停留在输入孔的底部
错误的引物浓度 使用建议的引物和探针浓度
纳米微孔板在扩增过程中
的蒸发
使用封板滚轮和封膜仔细地密封纳米微孔板(包括边缘)
输入孔中存在气泡; 小心移液;仅通过握住侧边缘来运送纳米微孔板;
不要掉落或翻转纳米微孔板
样本转移至纳米微孔板时出现干扰或
操作不当(因此并非所有样本都收集
在输入孔的底部)
阳性和阴性反应分区之间
没有清晰的分离
扩增条件欠佳 增加循环次数(但不能超过 50 次);将延伸时间增加至 2 分钟、
变性时间增加至 1 分钟(对于较长的扩增子尤为重要);
进行连续梯度稀释以确定 DNA 的最佳投入量
使用 EvaGreen 时
无法分离阳性和
阴性反应分区
引物或 DNA 起始
量过多
使用建议的引物浓度;不要过量加载
样本
片段长度过长 通过限制性酶切使片段长度均匀化
出现背景“雨滴”
(不属于阳性或阴性
群体的反应分区)
非特异性结合 不要过量加载引物;尝试提高退火温度、
减少循环次数、减少延伸和退火时间;
确保试剂无杂质
靶标可及性差 使用限制性酶切(避免切割靶标序列)或超声处理;
解决 RNA 二级结构问题:尝试改变靶标位置
或在更高的温度下进行逆转录
由于某些反应分区的部分抑制,
PCR 开始较晚
减少样本加载量;进一步稀释样本;
更换核酸纯化方法或试剂盒
出现噪音(高于
阈值的阴性点簇)
固体或气泡污染物 准备纳米微孔板时要格外小心;如有可能,
手动检查结果以使其合理
仪器的光学系统问题 确保您的 dPCR 系统具有出色的光学技术和
高度的稳定性
出现额外的意外簇
相应靶标的序列
变异
如果不需要意外簇:将阈值设置为高于该簇
以将其排除在定量之外,提高退火温度以提高
特异性,使用限制性酶以切割非特异性靶标,
重新设计引物或探针以减少与脱靶序列
的互补性;如果簇代表潜在的
功能同源物,考虑降低退火温度,使两个簇
合并为一个簇
部分孔未有浓度
检出
反应混合物配制或
样本制备问题
确保正确设置 dPCR assay,并且 DNA 投入量
和纯度令人满意
纳米微孔板在运送过程中
处理不当(摇晃、掉落)
在样本制备过程中要格外小心,将 dPCR 反应混合物
移液到纳米微孔板中,仅通过侧边缘抓握
纳米微孔板,在装入 dPCR 系统之前避免翻转、摇晃和
掉落;如有可能,在软件上手动设置一个阈值
来计算某个浓度
微孔板密封不当
(从侧面蒸发)
使用封板滚轮和封膜小心地密封微孔板
检测到的浓度过低 dPCR assay 设计不理想 运行温度梯度实验,以确保 dPCR assay 在最佳条件下运行;
确认荧光基团未与 G 残基结合;使用推荐的
引物和探针浓度
靶标可及性差 使用限制性酶切(避免切割靶标序列)
或超声处理
样本中存在 PCR 抑制剂 更换核酸纯化方法/试剂盒;添加辅助剂,
如 BSA
误差线大(结果不一致) 反应混合物混合不均匀 充分混匀反应混合物
热循环仪温度均一性
问题
前5个循环将变性温度从 94℃
提高到 96℃

dPCR 优化的更多支持

参考文献

Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)

Lindner L et al.Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies.Methods.2021; 191(4):95-106.

Pecoraro S et al.Overview and recommendations for the application of digital PCR.EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019

QIAGEN.QIAcuity User Manual Extension.June 2021.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal.Journal of Applied Microbiology.2012; 113(5):1014-1026.

Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions.Analytical and Bioanalytical Chemistry.2020; 412:2009-2023. 

The dMIQE Group and Hugget JF.The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020.2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.