数字 PCR 实验流程 — 概述
样本制备 — dPCR assay
样本纯度
由于 PCR 依赖于多轮酶促反应，与单步酶促反应相比，其对蛋白质、酚/氯仿、盐和 EDTA 等杂质更为敏感。核酸模板的纯度对 dPCR 而言非常重要，因为污染物会干扰荧光检测。
- 醇类（乙醇、异丙醇）和盐会影响引物和探针的退火性能、降低扩增效率（如降低阳性荧光信号）以及阻碍阳性和阴性反应分区的区分
- 腐殖酸会淬灭 dsDNA 结合染料（如 EvaGreen）的荧光
- 核酸酶会降解 RNA 和 DNA
- 尿素和苯酚会使 Taq 聚合酶变性
- 酸性多糖会模拟核酸并与 Taq 聚合酶形成末端复合物
尽管与 qPCR 相比，dPCR 对抑制剂耐受度更强，但使用高纯度模板的效果更佳。根据模板的不同，有多种试剂盒（如基因组 DNA、质粒 DNA、总 RNA 等）可实现高核酸纯度和 PCR 效率。
样本完整性：长度和序列
扩增子长度和序列与模板纯度一样影响 dPCR 实验的成功。降解严重的 RNA 和 DNA 模板，往往 OD 值定量的 DNA 数量与 dPCR 扩增和检测到的拷贝数之间存在差异。实现期望的灵敏度（如突变检测），可能需要高于预期的 DNA 数量。建议保持扩增子尽可能短，特别是当使用降解严重的样本时（FFPE DNA、cfDNA）。同样，残留的交联可以阻止链分离和扩增，无碱基位点可以诱导非特异性扩增。可使用从 FFPE 样品中回收高质量 gDNA 的专用试剂盒和方案。
以下情况，建议在数字 PCR 检测之前使用限制性酶切：
- 高黏度溶液 – 高黏度可能会降低检测的准确性，尤其是在较小的体积中使用较大量 DNA 时。使用限制性酶切降低黏度，可在 dPCR 实验流程中使用更高的 DNA 浓度 (1 µg)。
- 连锁或串联基因拷贝 – 如果一个阳性反应分区包含多个拷贝，则连锁的拷贝将被计为一个拷贝。可以通过使用限制性酶切来物理分离基因拷贝，以独立分离至反应分区来克服这个问题。
- 超螺旋质粒 – 建议使用限制性酶切使质粒 DNA 线性化，并提高引物/探针与 DNA 结合的可及性和效率。这会提高质粒定量的准确度。
- 长片段 DNA 分子 (>30 kb) – 长片段 DNA 分子可能会被不均匀地微分化，进而导致模板浓度过度定量。限制性酶切有助于将长片段模板切割为短片段，从而实现均匀分布和更准确定量。
样本投入量
样本投入量取决于所使用的 dPCR 技术。在 QIAcuity 纳米微孔板数字 PCR 中，26k 纳米微孔板每个反应最多可投入 217,000 个拷贝，8.5k 纳米微孔板每个反应最多可投入 170,000 个拷贝。如何计算拷贝数
如果生物体的单倍基因组大小是已知的，可通过使用下列方程式计算出基因组 DNA (gDNA) 输入质量与获得的拷贝数（对于单拷贝基因）之间的相关性：
基因组大小 (bp) x 单个碱基对的平均重量 (1.096 x 10–21 g/bp)
例如，对于基因组大小约为 3.3 x 109 bp 的人类基因组，计算如下：
3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
下表显示了几种模式生物 10 ng gDNA 的拷贝数
| 生物体 | 基因组大小 | 10 ng gDNA 基因拷贝数（1 个拷贝/单倍体基因组） |
|---|---|---|
| 人类 | 3.3x109 | 3000 |
| 斑马鱼 | 1.7x109 | 5400 |
| Saccharomyces cerevisiae | 1.2x107 | 760,500 |
| Escherichia coli | 4.6x106 | 2,000,000 |
| 标准质粒 DNA | 3.5x103 | 2,600,000,000 |
样本重复
建议对样本进行一式两份或一式三份分析，以防止因移液误差导致的定量偏差。复孔数据相加会增加检测事件数量。这有助于提高数字 PCR 检测的精确度。
对照
- 阴性对照 – 需要监测假阳性反应，可能是污染或引物和探针的问题引起的。阴性对照也被用于确定检测限 (LOD)。
- 阳性对照 – 用于测试在设定的反应条件下模板是否会发生扩增
- 无模板对照 (NTC) – 质控所有试剂中的污染
检测化学试剂
如何设计引物和探针
引物和探针的存储
除了谨慎的 assay 设计以及恰当浓度外，引物和探针的正确存储对 dPCR 的成功也至关重要。
冻干的引物和探针应溶解在少量低盐缓冲液中，如 100 µM TE 缓冲液 (10 mM Tris·Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)，以获得浓缩储存液。作为例外，Cy5 和 Cy5.5 荧光基团标记的探针应储存在 pH 7.0 的 TE 缓冲液中，因为它们在较高的 pH 下会发生降解。
引物存储时，小等份溶于无核酸酶 TE 缓冲液中可在 -20°C 保存至少 1 年。荧光标记的探针在相同的条件下可稳定 6 至 9 个月。应避免反复冻融，降低降解风险。
对于 dPCR 多重检测引物-探针组合，可使用 20x 引物-探针混合物，在建议浓度下针对特定靶标有 2 个引物和 1 个探针。
溶解引物和探针，应将含有冻干引物或探针的试管轻轻离心，以收集管底部的所有物质。加入所需体积的无菌无核酸酶 TE 缓冲液，混匀后静置 20 分钟，使引物或探针完全溶解。引物或探针溶液应再次混合，并用分光光度法测定浓度。dPCR 故障排查提示避免将引物和探针溶解在水中。其中一些引物和探针在水中的溶解度和稳定性比在 TE 缓冲液中低。
dPCR 运行
样本加载技巧
三个步骤的第一步是制备和加载样本。在 PCR 混合物制备和加载纳米微孔板的过程中，可以参考以下建议：
- 清洁工作场所和实验室器具，以降低外来 DNA 污染风险
- 为确保最高的 PCR 效率，在进行主要数字 PCR 检测之前，可对不同稀释度样本进行测试
- 在反应混合物制备之前，请解冻所有组分并充分混匀以获得均匀的溶液，短暂离心以避免溢出。
- 将预混液与样本、引物、无 RNAase 水以及限制性酶（如果使用）混合
- 使用无菌移液器吸头
- 使用移液器将反应混合物移入纳米微孔板内。确保在样本转移和微孔板下游运送过程中，没有气泡被引入到板孔中
- 为防止蒸发和污染，请使用封板滚轮和封膜小心地密封纳米微孔板
- 将纳米微孔板放入 dPCR 仪器时，只需握住微孔板的侧边缘，避免摇晃或转动，以确保 dPCR 反应混合物停留在输入孔的底部
- 设置软件并启动 dPCR 运行
扩增技巧
三个步骤的第二步是运行 dPCR 程序。在该步中，每个孔中的反应混合物被微分化为成千上万个反应单元。在热循环模块上进行 PCR 反应。如果反应分区内存在靶标模板，则在成像期间可检测到阳性荧光信号。图像由专用软件进行处理。 通过dPCR 仪器本身或使用连接的软件，可监测当前的微孔板状态。
获得最佳扩增和 PCR 效率的技巧包括：
- 退火温度 – 影响 dPCR assay 的特异性，通常设置为 55°C 和 65°C 之间，当阳性和阴性反应分区达到最大分离时为最佳的退火温度；提高退火温度有利于改善阳性信号与背景噪音间的分离
- 扩增循环 – 建议运行 40 个扩增循环，以实现阳性信号与背景噪声之间的充分分离。在一些情况下，可能必须提高热循环数量，以实现优异的性能
数字 PCR 数据分析
三个步骤的最后一步，使用基于泊松分布统计公式的绝对定量进行数字 PCR 数据分析。
QIAcuity Software Suite 可以根据具体的应用目的进行数字 PCR 数据分析：绝对定量、突变检测、基因组编辑、拷贝数变异或基因表达。在绝对定量分析（一级分析）中，该软件生成浓度图以及所选板孔阳性和阴性反应分区视图。热图视图可并列显示靶标通道和参比通道。直方图和散点图可用于更改阈值设置和重新计算结果。在 QIAcuity Software Suite 中，您可以创建关于微孔板分析结果的报告。绝对定量是所有后续计算和二级分析（如突变检测分析、基因表达分析、拷贝数变异分析等）的先决条件。
数字 PCR 数据分析技巧：
- 将阳性和阴性反应分区的分类阈值设置为略高于阴性反应分区簇
- 使用仅具有阴性反应分区的 NTC 样本来协助设置阈值，同时也可对所有板孔进行检查
- 您可以将单个孔的荧光振幅设置为略高于或低于 NTC，以避免某些反应分区的错误分类
- 尽管不存在共识值，但当阳性反应分区数超过 2 个时，反应通常被认为是阳性
- 为解决孔与孔之间和批次与批次之间的差异，可使用体积精度因子 (VPF) 来定义每个孔的确切体积，并通过软件应用该因子进行浓度计算
数字 PCR 数据示例
数字 MIQE ( dMIQE) 指南
dMIQE 指南清单中的条目被认为是发表 dPCR 结果时必须报告的内容。需要报告的信息包括但不限于：
- 每个反应分区的平均 DNA 靶标拷贝数 (λ)
-
反应分区数（与平均 DNA 靶标拷贝数一起，这些值可以确定 dPCR 检测的精确度）
-
模板结构信息，因为样本的性质可能会影响数据的准确性和可靠性：
- 单个反应分区模板类型：基因组、质粒等。
- 来源：生物体、组织、细胞、食物、植物等。
- 处理：限制性酶切、超声处理、预扩增、稀释、无
- 单个反应分区体积，该体积因 dPCR 平台而异
- 反应总体积，可通过反应分区数量乘以反应分区体积来计算
- 所用的对照品类型
- 阳性和阴性实验数据的代表性扩增图或终点荧光值
- 实验方差示例，最好来自多个生物重复，以便更准确地捕捉实验的不确定性
- 其他
如何实现 qPCR 到 dPCR 的优化转移
dPCR assay 优化参数
| 条件 | 变量对下列因素的影响 | 范围 |
|---|---|---|
| 退火温度 | •特异性 •阳性和阴性反应分区的分离 •Assay 人工产品 |
•理论或工作 Ta +/– 2.5ºC |
| 引物/探针浓度 | •阳性和阴性反应分区的分离 （增加阳性信号或减少阴性信号） |
•0.8 µm 引物；0.4 µm 探针（起点） |
| 热循环步骤 | •移除中间反应分区信号 | •2 次或 3 次（包括 72ºC 延伸） |
| 热循环重复次数 | •移除中间反应分区信号 | •30–60 次重复 |
然而，当使用一组新的 assay 时，建议进行初步试验测试来评估其性能。建议在适当的背景基质中使用特征良好且具有代表性的对照品。如果性能欠佳，则应优化 assay 以确保分析准确性。在这种情况下，报告优化过程的细节对重复性至关重要。
为了快速优化性能欠佳的 assay 方案，可在退火步骤运行温度梯度，QIAcuity 预混液也可在任何 qPCR 仪器上使用。
数字 PCR 故障排查
dPCR 实验可能受到与 qPCR 或常规 PCR 类似问题的影响。然而，在进行数字 PCR 检测时可能会出现一些特定的挑战。下表作为典型 dPCR 方案中常见问题的 dPCR 故障排查指南，概述了可能的原因和我们的专家建议。
| 问题 | 可能的原因 | 我们的建议 |
|---|---|---|
| 没有阴性反应分区 | 如果 NTC 孔有阴性反应分区： 样本靶标浓度过高 |
进行梯度稀释以确定 DNA 的最佳投入量 |
| 如果 NTC 孔只有阳性反应分区： 探针存储液长期不良储存 或聚合酶过早剪切探针 而导致探针水解 |
重新订购探针并制备新的探针储备液，或识别 assay 内相互作用，重新设计 dPCR assay 组分， 以减少结合和剪切 |
|
| 没有阳性反应分区 | 限制性酶可能在靶标序列 内部切割 |
针对使用不同限制性酶进行酶切的 DNA 和未酶切的 DNA 对 dPCR assay 进行测试 |
| 靶标序列是二级结构的一部分， 或包含环、重复、高 G/C 含量 |
重新设计另一个靶标使用限制性酶将输入的 DNA 切割为片段 （不切割靶标序列本身） |
|
| 扩增条件欠佳 | 执行退火/延伸温度梯度，以确定数字 PCR 方案 的最佳温度；调整物理参数（延伸时间、 等） |
|
| dPCR 部分抑制 | 更换核酸纯化方法/试剂盒；考虑添加 辅助剂，如 BSA |
|
| 引物或探针与预期靶标 区域不匹配 |
确保在 dPCR assay 设计或引物/探针合成过程中 没有出现错误 |
|
| NTC 孔出现阳性信号 | 试剂中存在模板/扩增子 污染 |
使用 5%–10% 漂白剂擦拭移液器、吸头盒和工作台面； 在单独的房间中制备样本并进行 dPCR； 穿戴适当的个人防护装备；含有 dUTP 的混合物 与热不稳定尿嘧啶 N-糖基化酶 (UNG) 一起使用可以减少因污染性 PCR 产物而产生的 假阳性数量，但对源自模板的污染物没有作用 |
| 阳性数量较少 | DNA 纯化不理想 | 仅使用经过纯化的 DNA；尝试替代方法/纯化试剂盒 |
| 样本或纳米微孔板加载不当 | 样本 DNA 加载量不要过多或过少；小心移液， 确保全部 dPCR 混合物都已转移至纳米微孔板； 确保样本停留在输入孔的底部 |
|
| 错误的引物浓度 | 使用建议的引物和探针浓度 | |
| 纳米微孔板在扩增过程中 的蒸发 |
使用封板滚轮和封膜仔细地密封纳米微孔板（包括边缘） | |
| 输入孔中存在气泡； | 小心移液；仅通过握住侧边缘来运送纳米微孔板； 不要掉落或翻转纳米微孔板 |
|
| 样本转移至纳米微孔板时出现干扰或 操作不当（因此并非所有样本都收集 在输入孔的底部） |
||
| 阳性和阴性反应分区之间 没有清晰的分离 |
扩增条件欠佳 | 增加循环次数（但不能超过 50 次）；将延伸时间增加至 2 分钟、 变性时间增加至 1 分钟（对于较长的扩增子尤为重要）； 进行连续梯度稀释以确定 DNA 的最佳投入量 |
| 使用 EvaGreen 时 无法分离阳性和 阴性反应分区 |
引物或 DNA 起始 量过多 |
使用建议的引物浓度；不要过量加载 样本 |
| 片段长度过长 | 通过限制性酶切使片段长度均匀化 | |
| 出现背景“雨滴” （不属于阳性或阴性 群体的反应分区） |
非特异性结合 | 不要过量加载引物；尝试提高退火温度、 减少循环次数、减少延伸和退火时间； 确保试剂无杂质 |
| 靶标可及性差 | 使用限制性酶切（避免切割靶标序列）或超声处理； 解决 RNA 二级结构问题：尝试改变靶标位置 或在更高的温度下进行逆转录 |
|
| 由于某些反应分区的部分抑制， PCR 开始较晚 |
减少样本加载量；进一步稀释样本； 更换核酸纯化方法或试剂盒 |
|
| 出现噪音（高于 阈值的阴性点簇） |
固体或气泡污染物 | 准备纳米微孔板时要格外小心；如有可能， 手动检查结果以使其合理 |
| 仪器的光学系统问题 | 确保您的 dPCR 系统具有出色的光学技术和 高度的稳定性 |
|
| 出现额外的意外簇 |
相应靶标的序列 变异 |
如果不需要意外簇：将阈值设置为高于该簇 以将其排除在定量之外，提高退火温度以提高 特异性，使用限制性酶以切割非特异性靶标， 重新设计引物或探针以减少与脱靶序列 的互补性；如果簇代表潜在的 功能同源物，考虑降低退火温度，使两个簇 合并为一个簇 |
| 部分孔未有浓度 检出 |
反应混合物配制或 样本制备问题 |
确保正确设置 dPCR assay，并且 DNA 投入量 和纯度令人满意 |
| 纳米微孔板在运送过程中 处理不当（摇晃、掉落） |
在样本制备过程中要格外小心，将 dPCR 反应混合物 移液到纳米微孔板中，仅通过侧边缘抓握 纳米微孔板，在装入 dPCR 系统之前避免翻转、摇晃和 掉落；如有可能，在软件上手动设置一个阈值 来计算某个浓度 |
|
| 微孔板密封不当 （从侧面蒸发） |
使用封板滚轮和封膜小心地密封微孔板 | |
| 检测到的浓度过低 | dPCR assay 设计不理想 | 运行温度梯度实验，以确保 dPCR assay 在最佳条件下运行； 确认荧光基团未与 G 残基结合；使用推荐的 引物和探针浓度 |
| 靶标可及性差 | 使用限制性酶切（避免切割靶标序列） 或超声处理 |
|
| 样本中存在 PCR 抑制剂 | 更换核酸纯化方法/试剂盒；添加辅助剂， 如 BSA |
|
| 误差线大（结果不一致） | 反应混合物混合不均匀 | 充分混匀反应混合物 |
| 热循环仪温度均一性 问题 |
前5个循环将变性温度从 94℃ 提高到 96℃ |
dPCR 优化的更多支持
参考文献
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Lindner L et al.Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies.Methods.2021; 191(4):95-106.
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