핵산 정량화를 포함하는 분자 생물학이나 유전체학 연구에 있어 과학자들은 종종 그들 자신이 갈림길에 서 있다는 것을 발견합니다. 연구 목적을 효율적으로 성취하기 위해 어느 정량화 기법을 선택해야 할까요 – 보다 정밀하고 강력한 디지털 PCR(dPCR) 아니면 보다 표준화되어 있고 친숙한 정량적 real-time PCR (qPCR). 그 선택은 애플리케이션에 달려 있습니다. 궁금하신 분들을 위해, 이 기사에서는 이 두 세대의 PCR 기법의 기술적 진화 그리고 실제적 응용에 대한 간략한 비교를 제공합니다.
1993년에 발견된 이래, 연구자들은 속도, 민감도, 특이성 및 사용 용이성에 대해 qPCR을 높이 평가해 왔습니다. 이 기법은 유전자 발현 실험, SNP 검출, 유전형 또는 대립 유전자 식별 수행 그리고 마이크로어레이 데이터 검증에 가장 유용합니다. 신중하게 설계된 qPCR 분석항목은 반응액당 표적 시퀀스의 여러 복제를 검출할 수 있어 광범위한 범위의 정량이 가능합니다. 사용자는 삽입염료(SYBR Green)에서부터 표적별 프로브(TaqMan, molecular beacons 등)에 이르는 검출 화학을 선택할 수 있습니다.1 검체당 비용은 유연성이 크며, 특정 연구 요구사항을 충족하기 위해 반응 볼륨, 처리량 및 검출 방법에 따라 조정됩니다. 또한, qPCR에 대한 MIQE 가이드라인에서는 검사실 간의 일관성과 실험 재현성 향상을 촉진했습니다.2
그러나, qPCR은 복제 수 변이 및 희귀 사례 검출 등과 같이 우월한 정확도와 민감도를 필요로 하는 애플리테이션에서는 저조한 것으로 나타났습니다. 그러한 애플리케이션에서 dPCR은 절대 복제 수를 측정하는 것뿐만 아니라 검출 한계를 극복, 즉 적은 배수 차이와 소량의 표적(target)을 검출함으로써, 다시 말해 건초더미에서 바늘을 찾음으로써 qPCR보다 우수한 성능을 보였습니다. 디지털 PCR은 표준 곡선 필요성을 제거하였고 분획물(partitions)의 종말점 형광도 측정 덕분에 억제제에 대한 감수성이 낮아졌습니다. PCR 효율 바이어스을 제거함으로써 오류율이 감소되었고, 이는 논란의 여지 없이 과학업계 공동체에서 인정한 사실입니다.3
역설적으로, 1990년대 초반에 “한계 희석 PCR” 또는 “디지털 PCR”이 출현하기는 하였으나 그 진전은 real-time PCR로 인해 지연되었습니다.4,5 그 이유는 무엇이었을까요? 기기 및 화학의 부족입니다. 다행스럽게도 보다 최근의 평가에서는 이 기술의 미래가 유망한 것으로 간주됩니다.6 디지털 PCR은 전부 아니면 전무의 간단한 접근 방식을 제공하며, 이는 지속적인 기술 향상과 MIQE 가이드라인의 발행과 병행하여 그 잠재력을 활용하고자 하는 관심을 다시 일으켰습니다.7 현재, 점점 더 많은 과학자들이 암 유전자 변이 연구, 면역요법 유효성 모니터링, 병원체 검출, GMO 분석, 유전자 편집 빈도 평가, 유전 질환의 산전 검사 등에 dPCR을 이용함으로써 응용 분야가 확대되고 있습니다.8
2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
1993년에 발견된 이래, 연구자들은 속도, 민감도, 특이성 및 사용 용이성에 대해 qPCR을 높이 평가해 왔습니다. 이 기법은 유전자 발현 실험, SNP 검출, 유전형 또는 대립 유전자 식별 수행 그리고 마이크로어레이 데이터 검증에 가장 유용합니다. 신중하게 설계된 qPCR 분석항목은 반응액당 표적 시퀀스의 여러 복제를 검출할 수 있어 광범위한 범위의 정량이 가능합니다. 사용자는 삽입염료(SYBR Green)에서부터 표적별 프로브(TaqMan, molecular beacons 등)에 이르는 검출 화학을 선택할 수 있습니다.1 검체당 비용은 유연성이 크며, 특정 연구 요구사항을 충족하기 위해 반응 볼륨, 처리량 및 검출 방법에 따라 조정됩니다. 또한, qPCR에 대한 MIQE 가이드라인에서는 검사실 간의 일관성과 실험 재현성 향상을 촉진했습니다.2
그러나, qPCR은 복제 수 변이 및 희귀 사례 검출 등과 같이 우월한 정확도와 민감도를 필요로 하는 애플리테이션에서는 저조한 것으로 나타났습니다. 그러한 애플리케이션에서 dPCR은 절대 복제 수를 측정하는 것뿐만 아니라 검출 한계를 극복, 즉 적은 배수 차이와 소량의 표적(target)을 검출함으로써, 다시 말해 건초더미에서 바늘을 찾음으로써 qPCR보다 우수한 성능을 보였습니다. 디지털 PCR은 표준 곡선 필요성을 제거하였고 분획물(partitions)의 종말점 형광도 측정 덕분에 억제제에 대한 감수성이 낮아졌습니다. PCR 효율 바이어스을 제거함으로써 오류율이 감소되었고, 이는 논란의 여지 없이 과학업계 공동체에서 인정한 사실입니다.3
역설적으로, 1990년대 초반에 “한계 희석 PCR” 또는 “디지털 PCR”이 출현하기는 하였으나 그 진전은 real-time PCR로 인해 지연되었습니다.4,5 그 이유는 무엇이었을까요? 기기 및 화학의 부족입니다. 다행스럽게도 보다 최근의 평가에서는 이 기술의 미래가 유망한 것으로 간주됩니다.6 디지털 PCR은 전부 아니면 전무의 간단한 접근 방식을 제공하며, 이는 지속적인 기술 향상과 MIQE 가이드라인의 발행과 병행하여 그 잠재력을 활용하고자 하는 관심을 다시 일으켰습니다.7 현재, 점점 더 많은 과학자들이 암 유전자 변이 연구, 면역요법 유효성 모니터링, 병원체 검출, GMO 분석, 유전자 편집 빈도 평가, 유전 질환의 산전 검사 등에 dPCR을 이용함으로써 응용 분야가 확대되고 있습니다.8
앞으로 나아갈 방향
실시간 및 디지털 PCR 기술은 미래의 성장에 대한 상당한 가능성을 보여주고 있습니다. qPCR이 검사실에서 표준 기술로 계속 사용되지는 하지만, dPCR의 뛰어난 민감도, 정밀도, 견고성, 재현성은 과학자들이 현 지식의 경계를 넓히는 데 도움이 될 것입니다. 최점단의 나노플레이트 기반 dPCR 기술 도입으로, 디지털로의 전환을 고려하는 검사실은 멀티플렉싱과 처리량에 있어 상당한 혜택을 볼 것입니다. 업계와 학계에서는 이러한 경쟁적 환경에 적응하고 변화하는 PCR의 세계에서 완벽한 균형을 찾아야 할 것입니다.참고 문헌
1. Deepak S.A. et al. Real-Time PCR: Revolutionizing detection and expression analysis of genes. Curr. Genom. 2007;8:234–251.2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.