dPCR의 진화
오늘날의 복잡한 연구 목적에는 기존 PCR 기술의 용량을 넘어서는 심도 있는 정보가 필요합니다. 3세대 디지털 PCR은 이러한 격차를 줄이고 일상적인 연구 목적을 다루는 훨씬 간단하고 실용적인 기술이 되고 있습니다.
디지털 PCR 기술의 개념은 1992년 Sykes 등이 ‘제한 희석 PCR’이라고 설명한 이래로 현재까지 이어져 오고 있습니다. 이 일반적인 방법은 end-point 분석과 푸아송 통계를 사용하여 샘플에 존재하는 핵산 분자의 절대적인 수를 정량화합니다. 그 후 1999년 Vogelstein과 Kinzler는 샘플을 희석하여 파티션이라는 개별 반응으로 분배하고 증폭 후 형광 신호가 있는 단일 생성물을 검출하고 분석하는 방법을 개발하는 혁신적인 연구를 수행했습니다. 그 후 Vogelstein과 Kinzler는 오늘날 모두가 알고 있는 ‘디지털 PCR’이라는 용어를 만들어 냈습니다.
수년에 걸쳐 이러한 방법은 혁신적으로 발전하고 상용화되어 더 널리 보급되었습니다. 미세유체 칩 및 디스크, 마이크로어레이 및 미세방울 또는 유수 에멀션 기반의 방울 결정에서 디지털 PCR을 수행할 수 있으며, 더 최근에는 qPCR과 유사한 플레이트에서 수행할 수 있습니다.
여전히 디지털 PCR이란 무엇인가에 대한 답을 찾고 있으세요? 디지털 PCR의 기본 사항, 장점, 한계 및 응용 분야에 관해 자세히 알아보려면 벤치 가이드를 확인하세요.
절대 정량화 4단계
나누어 정복하기
샘플을 준비하는 방식은 qPCR과 비슷하지만, 증폭 전에 샘플을 수천 개의 개별 반응으로 나누는 샘플 파티셔닝은 디지털 PCR의 고유한 특징입니다. 디지털 PCR은 qPCR의 일괄 분석과 달리 분자를 파티션으로 무작위 분배하여 경쟁 표적의 영향을 최소화하고 희귀한 표적의 검출 정밀도와 민감도를 높입니다.
이를 이용하여 연구자들이 다음을 할 수 있습니다.
- 낮은 존재비의 표적 또는 복잡한 백그라운드의 표적 정량화
- 대립 유전자 변이체(SNP) 검출 및 식별
- qPCR로는 감지할 수 없는 표적 수준의 미세한 배율 변화 모니터링
파티셔닝의 3대 이점
파티셔닝에 의미를 부여하는 푸아송의 법칙
Real-time qPCR과 달리 디지털 PCR은 표적 분자의 상대적인 양을 결정하기 위해 모든 증폭 사이클에 의존하지 않습니다. 대신, 푸아송 통계에 의존하여 end-point 증폭 후 절대적인 표적 양을 결정합니다.
표적 분자가 사용 가능한 모든 파티션에 무작위로 분포되기 때문에 푸아송 분포는 파티션당 평균 분자 수(영, 하나 또는 그 이상)를 추정하고 양성 파티션당 표적 분자의 복제 수를 계산합니다. 양성 및 음성 반응의 수를 푸아송 통계 분석하여 목표 염기서열을 정밀하고 절대적으로 정량화할 수 있습니다.
디지털 PCR에 관해 자주 묻는 질문과 간단한 답변
참고 문헌 목록
- Vogelstein B and Kinzler KW (1999). Digital PCR. Proc Nat Acd Sci USA 96, 9236–9241.
- Baker M (2012). Digital PCR hits its stride. Nat Methods 9, 541–544.
- Pohl G and Shih IeM (2004). Principle and applications of digital PCR. Expert Mol Rev Diagn 4, 41–47.
- Sykes PJ et al. (1992). Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques 13, 444–449.
- Morley AA (2014). Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif. 1(1):1-2.
- Quan PL et al. (2018). dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18(4):1271.