デジタルPCRプロトコール —概要
サンプル調製 — dPCRアッセイ
サンプルの純度
PCRは複数回の酵素反応に依存するため、シングルステップの酵素触媒反応に比べ、タンパク質、フェノール/クロロホルム、塩、EDTAなどの不純物に敏感です。汚染物質が蛍光検出を妨げる可能性があるため、dPCRでは核酸テンプレートの純度が重要です。
- アルコール（エタノール、イソプロパノール）と塩は、プライマーとプローブのアニーリング特性を損ない、増幅効率を低下させます。たとえば、陽性の蛍光が減少し、陽性と陰性パーティションの識別が阻害されます
- フミン酸は、dsDNA結合色素（EvaGreenなど）の蛍光を消します
- ヌクレアーゼはRNAとDNAを分解します
- 尿素とフェノールは、Taqポリメラーゼを変性させます
- 酸性多糖類は核酸を模倣し、Taqポリメラーゼとデッドエンド複合体を形成します
qPCRに比べて阻害効果を受けにくいにもかかわらず、dPCRはテンプレート純度の高いテンプレートを用いると最適に機能します。ゲノムDNA、プラスミドDNA、トータルRNAなど、テンプレートに応じて、高い核酸純度とPCR効率を実現するためのさまざまなキットが存在します。
サンプル完全性：長さとシークエンス
アンプリコンの長さとシークエンスは、dPCR実験の成功を決定するとき、テンプレートの純度と同じくらい大きな影響を与えます。強く分解されたテンプレートRNAとDNAは、ODで定量したDNA量と、dPCRで増幅し検出したコピー数との間にずれを示す傾向があります。目的の感度を得るには、予想より多くのDNA量が必要な場合があります（変異検出などで）。特に、強く分解されたサンプル（FFPE DNA、cfDNA）を使用する場合は、アンプリコンをできるだけ短くすることをお勧めします。同様に、残存する架橋結合は鎖の分離と増幅を妨げ、脱塩基部位は非特異的増幅を誘発する可能性があります。FFPEサンプルからの高品質gDNAの回収には、専用キットとプロトコールをご利用いただけます。
以下のいずれかの場合には、デジタルPCRアッセイの前に制限酵素消化を使用することをお勧めします。
- 高粘度溶液 – 高粘度は、特に少ない容量中で大量のDNAを使用すると、測定精度が低下する可能性があります。制限酵素消化を使用して粘度を下げると、dPCRプロトコールで、より高濃度のDNA（1 µg）を使用できます。
- 結合またはタンデム遺伝子コピー – 1つの陽性パーティションに複数のコピーが含まれている場合、結合したコピーは1コピーとしてカウントします。この問題は、制限酵素消化を使用して、遺伝子コピーを物理的に分離し、独立したパーティションに分離することで解決できます。
- スーパーコイルプラスミド – プラスミドDNAを線形化し、プライマー/プローブのDNAへの結合アクセスを改善し、効率を向上するために、制限酵素消化をお勧めします。これにより、プラスミドの定量精度が向上します。
- 大きなDNA分子 (>30 kb) – 大きなDNA分子は、不均一に分割され、テンプレート濃度の過剰定量につながる可能性があります。制限酵素消化により、大きなテンプレートを小さなサイズに断片化することで、均一な分配とより正確な定量が可能になります。
サンプルインプット量
サンプルインプット量は使用するdPCRテクノロジーに依存します。QIAcuityナノプレートデジタルPCRでは、1反応あたり、26kナノプレートでは最大217,000コピー、8.5kナノプレートでは最大170,000コピーが使用可能です。コピー数の計算方法
生物のハプロイドゲノムサイズが既知の場合、ゲノムDNA （gDNA）の質量インプット量と得られるコピー数（シングルコピー遺伝子の場合）の相関は、次の式で計算できます：
ゲノムサイズ（bp） x 単一塩基対の平均重量（1.096 x 10–21 g/bp）
たとえば、ゲノムサイズが約3.3 x 109 bpのヒトゲノムの場合、以下のような計算になります：
3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
下の表には、いくつかのモデル生物の10 ngのgDNAから得られたコピー数を示しています
| 生物 | ゲノムサイズ | 10 ngのgDNA中の遺伝子コピー（1コピー/ハプロイドゲノム） |
|---|---|---|
| ホモサピエンス | 3.3x109 | 3000 |
| ゼブラフィッシュ | 1.7x109 | 5400 |
| Saccharomyces cerevisiae | 1.2x107 | 760,500 |
| Escherichia coli | 4.6x106 | 2,000,000 |
| 標準的なプラスミドDNA | 3.5x103 | 2,600,000,000 |
レプリケート
ピペッティングエラーによる定量のバイアスを防ぐため、サンプルを2回または3回反復で分析することをお勧めします。2連データを足し合わせると、測定したイベント数が増えます。これはデジタルPCRアッセイの精度を高めるのに役立ちます。
コントロール
- 陰性コントロール – 汚染やプライマーやプローブの問題によって発生する可能性がある偽陽性反応を監視するために必要です。陰性コントロールは、検出限界（LOD）の決定にも使用されます。
- 陽性コントロール – 設定した反応条件下で、テンプレートの増幅が起こるかどうか調べるために使用します。
- テンプレートなしのコントロール（NTC） – すべての試薬の汚染を照合します。
検出ケミストリー
プライマーとプローブの設計方法
プライマーとプローブの保存
注意深いアッセイ設計と、適切な濃度のプライマーとプローブの使用とは別に、プライマーとプローブの正しい保存もdPCRの成功には不可欠です。
凍結乾燥したプライマーとプローブは、100 µM TEバッファー（10 mM Tris・Cl、1 mM EDTA、pH 8.0）などの少量の低塩バッファーに溶解し、濃縮ストック溶液を調製する必要があります。例外として、Cy5およびCy5.5蛍光色素で標識したプローブは、pHが高くなると分解する傾向があるので、Buffer TE、pH 7.0で保存する必要があります。
プライマーを保存する場合、ヌクレアーゼフリーTEバッファー中に少量分注されたものは-20℃で少なくとも1年間保存できます。蛍光標識プローブは、このような同じ条件下で6～9ヶ月間安定しています。分解リスクを減らすために、凍結融解サイクルの繰り返しを避ける必要があります。
dPCRマルチプレックスアッセイ用のプライマー-プローブセットでは、20xプライマー-プローブミックスを使用し、推奨濃度の特定のターゲットに2つのプライマーと1つのプローブを使用できます。
プライマーとプローブを再構成するには、凍結乾燥したプライマーまたはプローブを含むチューブを穏やかに遠心分離し、チューブの底にあるすべての物質を回収する必要があります。必要量の滅菌ヌクレアーゼフリーTEバッファーを加え、混合し、20分間放置してプライマーまたはプローブを完全に溶解する必要があります。プライマーまたはプローブの溶液を再度混合し、分光光度計で濃度を測定する必要があります。dPCRのトラブルシューティングのヒントは、プライマーやプローブを水に溶解しないことです。このようなプライマーやプローブの中には、TEバッファーよりも水への溶解度や安定性が低いものがあります。
dPCRランを実行
サンプルロードのヒント
3つのdPCR反応ステップの最初のステップは、サンプルの調製とロードです。PCRミックスを調製し、ナノプレートをロードするとき、以下の推奨事項を考慮してください。
- 作業スペースと実験器具を除染し、外来DNA汚染のリスクを低減します
- 最大限のPCR効率を確保するには、メインのデジタルPCRアッセイの前に、さまざまな希釈液中のサンプルをテストしてください。
- 反応混合物を調製する前にすべての成分を完全に解凍し、均質な溶液を得られるように成分を十分に混合し、スピルオーバーしないように短時間遠心します。
- マスターミックスとサンプル、プライマー、RNAaseフリー水、もし使用する場合は制限酵素も混ぜ合わせます
- 滅菌ピペットチップを使用
- 反応混合液をナノプレートにピペットで移します。サンプルを移す際やプレートのダウンストリーム輸送中に、dPCRナノプレートのウェルに気泡が混入しないようにしてください
- 蒸発や汚染を防ぐため、ローラーを使用してナノプレートをフィルムで慎重に密閉します
- dPCR反応ミックスがインプットウェルの底に留まるように、振ったり回転させたりしないで、プレートの側端のみを持ち、ナノプレートをdPCR装置に運びます
- ソフトウェアをセットアップし、dPCRランを開始
増幅のヒント
3つのdPCR反応ステップの2番目のステップでは、増幅を通じてdPCRプロトコールを実行します。このステップでは、各ウェルの反応ミックスが何千もの個々の反応に分離します。PCR反応はサーモサイクラーで実行されます。テンプレート材料がパーティション内に存在すると、イメージング中に陽性蛍光シグナルが検出されます。画像は専用ソフトウェアで処理されます。現在のプレートの状態は通常、dPCR装置自体または接続したソフトウェアスイートを使用してモニターできます。
最適な増幅条件とPCR効率を達成するためのヒントは以下の通りです。
- アニーリング温度 - dPCRアッセイの特異性に影響を与える可能性があります。通常、55℃から65℃の間に設定され、最適なアニーリング温度は、陽性パーティションと陰性パーティションの間の分離が最大になった時に得られます。アニーリング温度を上げると、陽性シグナルとバックグラウンドノイズの分離を改善するのに有効な場合があります
- 増幅サイクル - 陽性シグナルとバックグラウンドノイズを十分に分離するために、少なくとも40回の増幅サイクルを実行することをお勧めします。場合によっては、最適な性能を得るために熱サイクルの回数を増やさなければならないこともあります。
デジタルPCRデータ分析
3つのdPCR反応ステップの最後のステップは、ポアソン統計に基づく絶対定量によるデジタルPCRデータ分析です。
QIAcuity Software Suiteは、絶対定量、変異検出、ゲノム編集、コピー数多型、遺伝子発現などのアプリケーションの目的に応じて、デジタルPCRデータ分析を実行できます。絶対定量分析（第1レベル分析）で、ソフトウェアは、選択したウェルの濃度図と陽性および陰性パーティション図を作成します。ヒートマップビューでは、ターゲットチャンネルとリファレンスチャンネルを並べて表示します。ヒストグラムと散布図を使用して、閾値の設定を変更し、結果を再計算できます。QIAcuity Software Suiteでは、プレートの分析結果に関するレポートを作成できます。絶対定量は、その後のすべての計算と第2レベル分析（変異検出分析、遺伝子発現分析、コピー数多型分析など）の前提条件です。
デジタルPCRデータ分析のヒント：
- 陰性パーティションのクラスターのすぐ上で、パーティションを陽性か陰性かに分類するための閾値を設定します
- 閾値の設定には、陰性パーティションのみを含むNTCサンプルを使用しますが、全てのウェルの検査も実施します
- 個々のウェルの蛍光振幅をNTCよりもわずかに高く、あるいは低く設定すると、一部のパーティションの誤分類を避けることができます
- コンセンサス値は存在しませんが、通常、陽性パーティション数が2を超えると、反応を陽性とみなします
- ウェル間およびバッチ間のバラツキに対処するため、volume precision factor（VPF）（容積精度係数）を使用して各ウェルの正確な容積を定義し、ソフトウェアによる濃度計算にその係数を適用してください。
デジタルPCRデータの例
デジタルMIQE（dMIQE）ガイドライン
dMIQEガイドラインのチェックリストの項目は、dPCRの結果を公表する際の報告に必須とされています。報告が必要な情報は以下の通りですが、これらに限定されません。
- パーティションあたりの平均DNAターゲットコピー数（λ）
-
使用したパーティション数（平均DNAターゲットコピー数と合わせて、これら値によってdPCRアッセイの精度を決定できます）
-
サンプルの性質がデータの精度や信頼性に影響を与える可能性があるため、テンプレートの構造情報：
- 個々のパーティションテンプレートのタイプ：ゲノム、プラスミドなど
- ソース：生物、組織、細胞、食品、植物など
- 処理：制限酵素消化、超音波処理、前増幅、希釈、なし
- 個々のパーティション容量。この容量はdPCRプラットフォームによって異なる可能性があるため。
- 総反応量：パーティション数にパーティション量を乗じることで算出できます
- 使用するコントロールのタイプ
- 陽性および陰性実験データの代表的な増幅プロットまたはエンドポイント蛍光値
- 実験の不確実性をより正確に把握するために、できれば複数の生物学的レプリケートから得られる実験のばらつきの例
- その他
qPCRからdPCRにアッセイに移行して最適化する方法
dPCRアッセイ最適化のパラメーター
| 条件 | さまざまな影響 | 範囲 |
|---|---|---|
| アニーリング温度 | ・特異性 ・陽性パーティションと陰性パーティションの分離 ・アッセイアーチファクト |
・理論的または実際のTa +/– 2.5ºC |
| プライマー/プローブ濃度 | ・陽性パーティションと陰性パーティションの分離 （陽性シグナルを増加または陰性シグナルを減少） |
・0.8 µmプライマー、0.4 µmプローブ（出発点） |
| サーマルサイクリングステップ | ・中間パーティションシグナルを削除 | ・2または3（72ºC伸長を含む） |
| サーマルサイクル反復回数 | ・中間パーティションシグナルを削除 | ・30～60回反復 |
しかし、新しいアッセイを導入する際には常に、最初にパイロットテストを行って性能を評価することを推奨します。また、適切なバックグラウンドマトリックスで、十分に特性を明らかにした代表的なコントロールを使用することを推奨します。性能が最適でない場合は、分析精度を確保するためにアッセイを最適化する必要があります。このような場合、最適化プロセスの詳細を報告することが再現性のために重要です。
最適ではないアッセイを迅速に最適化するには、アニーリングステップの温度勾配を実施しますが、QIAcuityマスターミックスはどのようなreal-time PCR装置でも実行できます。
デジタルPCRトラブルシューティング
dPCR実験は、qPCRや伝統的または従来のPCRと同様の問題に影響されることがあります。しかし、デジタルPCRアッセイを行う際に、いくつかの特定の課題が発生する可能性があります。以下の表は、典型的なdPCRプロトコールでよく発生する問題に対するdPCRトラブルシューティングガイドとして使用でき、考えられる原因と専門家の推奨事項を概説しています。
| 問題 | 考えられる原因 | 弊社の推奨事項 |
|---|---|---|
| 陰性パーティションがない | NTCウェルに陰性パーティションがある場合： サンプルの目標濃度が高すぎます |
希釈系列を実行し、最適なインプットDNA量を決定します |
| NTCウェルに陽性パーティションしかない場合： プローブストック溶液の不適切な長期保存 によるプローブの加水分解、またはポリメラーゼによる プローブの早期開裂。 |
プローブを再注文し、新しいプローブストック溶液を調製するか、 アッセイ内相互作用を特定し、dPCRアッセイコンポーネントを再設計し 、結合と開裂を低減します。 |
|
| 陽性パーティションがない | 制限酵素がターゲットシークエンス内で 切断した可能性があります |
異なる制限 酵素で消化したDNAと未消化DNAに対してdPCRアッセイをテストします |
| ターゲットシークエンスが二次 構造の一部である、またはループ、反復、 高いG/C含量を含んでいる |
別のターゲット用に再設計します。制限酵素を使用して インプットDNAを断片化します（ターゲットシークエンス自体は切断しないようにしてください）。 |
|
| 増幅条件が最適でない | アニーリング/伸長温度勾配を行い、デジタルPCRプロトコールの 最適温度を決定します。物理的 パラメーター（伸長時間）を調整します |
|
| 部分的なdPCR阻害 | 核酸精製の方法/キットを変更します。BSAなどの 反応促進剤の添加を検討します |
|
| プライマーやプローブが予想したようにターゲット 領域にマッチしない |
dPCRアッセイの設計やプライマー/プローブの合成 にエラーがないことを確認します |
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| NTCウェルから陽性シグナル | 試薬中のテンプレート/アンプリコンの汚染 |
ピペット、チップボックス、ベンチトップを5%～10%の漂白剤でしっかり拭きます。別々の部屋で、 サンプルを調製し、dPCRを実行します。 適切な個人用保護具を着用します。dUTPを含むミックスと 熱不安定性ウラシルN-グリコシラーゼ（UNG）は、汚染したPCR産物由来の偽陽性 数を削減できますが、 テンプレート由来の汚染物質には影響を与えません |
| 陽性数が少ない | DNA精製不良 | 精製したDNAのみを使用し、別の方法/精製キットを試す |
| サンプルまたはナノプレートの不適切なロード | サンプルDNAをオーバーロードしたり、アンダーロードしたりしないでください。慎重にピペッティングし、 dPCRミックス全体がナノプレートに移されたことを確認します。サンプルがインプットウェルの底に 残っていることを確認します |
|
| 間違ったプライマー濃度 | 推奨されるプライマーとプローブの濃度を使用してください。 | |
増幅中のナノプレートからの蒸発 |
ローラーとラバーシールを使って、ナノプレートを慎重に（端の周囲も）密閉 | |
| インプットウェルに気泡 | 慎重にピペッティングし、側面の 端のみを持ってナノプレートを輸送します。ナノプレートを落としたり、逆さにしたりしないでください |
|
妨害やナノプレートへのサンプルの不適切な移動（そのため、すべてのサンプルが インプットウェルの底で回収されるわけではない）。 |
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陽性パーティションと陰性パーティションが明確に分離されない |
最適以下の増幅条件 | サイクル数を増やします（ただし50サイクルを超えない）。 ランプレートを下げます（例：2℃/秒）。伸長時間を2分に、 変性時間を1分に延ばします（特に長いアンプリコンに重要）。 連続希釈を行い、最適インプットDNA量を決定します |
| EvaGreen を用いて作業するとき、陽性パーティションと 陰性パーティションを分離できない |
プライマーまたはDNA 出発材料の量が多すぎる |
推奨濃度のプライマーを使用する。 出発物質をオーバーロードしない |
| フラグメントが長すぎる | 制限酵素消化によりフラグメント長を均一にする | |
| バックグラウンド「レイン」 （ 陽性集団にも陰性集団にも属さないパーティション）の出現 |
非特異的結合 | プライマーをオーバーロードしないでください。アニーリング温度を上げたり、 サイクル数を減らしたり、伸長およびアニーリング時間を短くしたりしてみてください。 試薬に不純物がないことを確認してください |
| ターゲットへのアクセスが不良 | 制限酵素消化（ターゲットシークエンスの切断を避ける）または 超音波処理を使用。RNAの二次構造に対処するため、ターゲットの 位置を変えるか、より高い温度で逆転写を実施。 |
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| 一部のパーティションの部分的阻害 のため、PCRの開始が遅れる |
ロードするサンプル量を減らします。サンプルをさらに希釈します。 核酸精製方法やキットを変更します |
|
| ノイズの出現（閾値以上の 陰性ポイントのクラスター） |
固体や気泡の汚染物質 | ナノプレートを調製するときには細心の注意を払います。可能であれば結果をマニュアルで調べて、 把握します |
| 装置の光学的問題 | dPCRシステムが優れた光学技術を持ち、光学的安定性が 高いことを確認します |
|
| 予想外の余分な クラスターの出現 |
対象ターゲットのシークエンス変異 |
予想外のクラスターを望まない場合：クラスター の上に閾値を設定して定量から除外する、アニーリング温度を高くして 特異性を高める、制限酵素で消化して 非特異的ターゲットを切断する、プライマーやプローブを再設計して ターゲット外のシークエンスとの相補性を低減する。クラスターが潜在的機能 ホモログを示す場合：アニーリング温度を低くして2つの クラスターが1つのクラスターに統合されるようにすることを検討 |
一部のウェルで濃度測定が行われていない |
反応 混合物のアセンブリやサンプル調製に問題がある |
dPCRアッセイが適切にセットアップされ、DNAインプットと 純度が満足いくものであることを確認します |
| 輸送 中のナノプレートの不適切な取り扱い（揺らす、落とす） |
サンプルを調製するとき、dPCR反応 ミックスをナノプレートにピペッティングするとき、細心の注意を払い、ナノプレートの側面の端だけを持ち、dPCRシステムにロードする前に 倒したり、振ったり、落としたりしない。 可能であれば、ソフトウェアに閾値を手動設定し、特定の濃度を 計算します |
|
| プレートの密閉が不適切 （側面から蒸発） |
ローラーを用いてホイルでプレートを慎重に密封します | |
| 測定した濃度が低すぎる | dPCRアッセイ設計が不良 | 温度勾配実験を行い、dPCRアッセイ が最適な条件で実行されていることを確認します。蛍光色素が G残基に結合していないことを確認します。推奨濃度のプライマーとプローブを追加します |
| ターゲットへのアクセスが不良 | 制限酵素消化（ターゲットシークエンスの切断を避ける） または超音波処理を使用します |
|
| サンプルにPCR阻害物質が含まれている | 核酸精製の方法/キットを変更、 BSAなどの反応促進剤を添加 |
|
| エラーバーが大きい（一貫性のない結果） | 反応混合物の混合が不十分 | 反応混合物を完全に混合 |
| サーマルサイクラーの 温度均一性に問題がある |
最初の5サイクルでは、変性温度を94℃から96℃に上げます |
dPCR最適化によりさらにサポート
参考文献
Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)
Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.
QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.
Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.
Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023.
The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.