dPCR vs qPCR – QIAGEN

Choisir la dPCR ou la qPCR – Découvrez les avantages et voyez si cela répond à vos objectifs de recherche

Lorsqu’on compare les technologies de dPCR et de qPCR, la principale différence est la précision. Si les deux technologies proposent une détection et une quantification particulièrement sensibles et fiables des acides nucléiques, leur principale différence est comparable à celle de la radio analogique par rapport à la radio numérique, d’après le Dr Jim Huggett, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. « Avec une radio analogique, il faut d’abord régler le cadran pour obtenir la station souhaitée avec le moins d’interférences possible. La qualité dépend de la réception et le signal subit des interférences parasites. Ça, c’est la PCR quantitative. Elle est fiable, mais nécessite une optimisation pour un résultat correct, et même après, il faut faire face à un bruit de fond. Avec la radio numérique, il suffit de demander la station pour la trouver, avec un signal net, ou pas. Ça, c’est la PCR digitale, qui offre des résultats binaires précis. Elle compte littéralement les molécules d’ADN présentes ou absentes. La clarté des résultats associée à un faible taux d’erreur lui confèrent un niveau incroyablement élevé de précision. La PCR digitale est parfaitement adaptée pour mesurer des différences quantitatives plus faibles. »

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Comparer et décider : qPCR vs dPCR

Les chercheurs apprécient la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la facilité d’utilisation de la PCR quantitative Cette technique est particulièrement utile pour l’analyse d’expression génique, la détection d’agents pathogènes et l’analyse du microbiome, ainsi que pour la validation des données de puces à ADN. Cependant, la PCR quantitative a montré ses limites dans des applications nécessitant une précision et une sensibilité supérieures, telles que l’analyse de variation du nombre de copies, la détection des mutations et SNP ainsi que la discrimination allélique. Dans de telles applications, la PCR digitale surpasse la PCR quantitative en permettant non seulement de mesurer le nombre de copies absolu, mais aussi de dépasser les limites de détection, c’est-à-dire de détecter les différences de moindre ampleur exprimées à 10 % de précision et les taux de mutation < 1 %.

La PCR digitale fait également preuve d’une quantification robuste, c’est-à-dire d’une grande tolérance aux inhibiteurs de la PCR et moins affectée par les changements d’efficacité de la PCR dus au fractionnement de l’échantillon et au cycle de point final.

Real-Time PCR/qPCR	PCR digitale
Quantitative, relative ou absolue, mais les courbes d’étalonnage ou les échantillons de référence sont nécessaires	Quantitative, absolue et aucun étalon ni aucune référence n’est nécessaire
PCR d’un volume d’échantillon important Volumes réactionnels flexibles Les variations d’efficacité de la PCR ont un impact, car les données sont collectées en phase exponentielle Sensibilité aux inhibiteurs	Fractionnement d’échantillon Tolérance aux inhibiteurs supérieure/fiabilité accrue Les variations d’efficacité de l’amplification n’ont aucun impact Puissance statistique supérieure grâce à la loi de Poisson
Mesure l’amplification par PCR à chaque cycle	Mesure à la fin des cycles de PCR
Détecte un taux de mutation de > 1 %	Détecte un taux de mutation de ≥ 0,1 % (rapport signal/bruit élevé)
Protocoles bien établis	Précision supérieure pour une reproductibilité supérieure parmi les laboratoires

Les réactions de PCR digitale restent fiables même en présence d’inhibiteurs tels que l’acide humique et l’héparine. Les réactions de qPCR (sur le Rotor-Gene Q) et de PCR digitale (sur le QIAcuity) ont été effectuées en présence de quantités indiquées d’inhibiteurs à l’aide du QIAcuity PCR Master Mix (EvaGreen) correspondant et avec des volumes réactionnels identiques. La quantification affiche les Cq (qPCR) ou les copies/µl (dPCR) comme des différences de performances relatives parmi les échantillons avec l’échantillon non inhibé défini sur 100 %.

1 Cq en qPCR, qui représente 50 % de précision, équivaut à 10 % de précision en PCR digitale et correspond à une augmentation de la concentration ×2.

Quand utiliser la dPCR plutôt que la qPCR ?

Concernant leur recherche en biologie moléculaire et en génomique impliquant la quantification des acides nucléiques, les scientifiques se trouvent souvent à la croisée des chemins. Quelle technique de quantification choisir pour réaliser leurs objectifs de recherche avec efficacité : la PCR digitale (dPCR), plus précise et plus fiable, ou la Real-Time PCR quantitative (qPCR), plus normalisée et plus familière ? Les deux technologies présentent des similitudes, mais aussi des avantages et des limites, le choix dépend ainsi de l’application.

La grille d’applications ci-dessous indique le niveau d’adéquation de chaque technologie avec certaines des applications les plus courantes.

La PCR digitale en gouttelettes (ddPCR), l’une des premières formes de PCR digitale, présentait déjà des avantages par rapport à la qPCR pour la plupart des applications susmentionnées. Dans le match ddPCR vs qPCR, la qPCR se révèle adaptée aux applications qui nécessitent une plage dynamique importante, tandis que la ddPCR est plus adaptée aux applications qui nécessitent une précision supérieure ou l’analyse de l’abondance des fractions.

L’évolution de la ddPCR vers la dPCR sur nanoplaques a élargi le champ d’application de cette technologie pour inclure davantage d’applications. Le flux de travail de dPCR sur nanoplaques est nettement plus rapide grâce à la lecture simultanée de toutes les fractions d’échantillon, à l’automatisation frontale et à une configuration facile des plaques de type qPCR. Cette rapidité en fait une technologie adaptée au dépistage et aux applications à haut débit sans rogner sur la précision, l’exactitude et la sensibilité.

Découvrez ce que la PCR digitale peut vous apporter

La PCR digitale, et plus particulièrement la technologie sur nanoplaques de QIAGEN, peut répondre dès aujourd’hui à vos questions, en vous offrant toute une gamme d’applications.

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Le flux de travail de la dPCR sur nanoplaques QIAcuity : tout comme la qPCR… mais en mieux

Tout comme dans les expériences de qPCR, la préparation des échantillons comprend le transfert du Master Mix, des sondes et des amorces sur une nanoplaque à 96 ou 24 puits, suivi de l’ajout des échantillons. Le système intègre le fractionnement, le thermocyclage et l’imagerie dans un seul instrument entièrement automatisé qui permet aux utilisateurs de passer de l’échantillon aux résultats en moins de 2 heures. Il est possible d’effectuer l’analyse à distance sur la suite logicielle, qui fournit la concentration de la séquence cible en copies par microlitre et permet le contrôle qualité pour les échantillons positifs ou les contrôles sans matrice (NTC).

Le passage de la qPCR à la dPCR est si facile que vous ne le remarquerez même pas

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Questions fréquentes (FAQ) sur le passage de la qPCR à la dPCR

D’autres experts utilisent-ils la dPCR sur nanoplaques au lieu de la qPCR ? Au moins 300 publications en 3 ans…

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