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Enzymes pour la biologie moléculaire

Clonage et recombinaison d’ADN

Extrémité cohésive ou franche : modification, renaturation et ligature

Les technologies de clonage et de recombinaison d’ADN ont permis de développer grandement nos connaissances de la manipulation des gènes et des cellules en matière de santé et de maladie. Les techniques et applications de clonage ont fait un bond en avant grâce à des applications innovantes telles que l’assemblage à haut débit d’échantillothèques et la cartographie de modifications épigénétiques.

Enzymes pour le clonage

Une modification terminale de l’extrémité peut être nécessaire avant de pouvoir cloner l'ADN matriciel en un vecteur plasmidique adapté. L’ADN identifié pour le clonage est généralement isolé à partir de la source par digestion d’enzymes de restriction ou amplification par PCR. Des enzymes spécifiques, telles que le fragment de Klenow, l’ADN polymérase T4 et la polynucléotide kinase T4, modifient les extrémités 3’ ou 5’ afin d’améliorer la liaison covalente entre les fragments d’ADN et le vecteur.

L’étape suivante du clonage est la ligature à une enzyme adaptée à la renaturation des extrémités du vecteur et de l’insert.

Une extension homopolymérique permet en général de préparer un vecteur T à utiliser dans un clonage TA ou d’ajouter une queue A à un produit de PCR issu d’une polymérase haute fidélité (autre que Taq) à utiliser dans un clonage TA. Les produits de l’amplification par Taq ADN polymérase ont déjà une queue A.

Modification terminale de l’ADN

*L’activité exonucléase 3’→5’ de l’ADN polymérase T4 est primordiale pour le protocole de la technique SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning - Clonage indépendant de la séquence et de la ligature).

† La conversion en ADN à extrémité franche se fait en exploitant les activités polymérase 5’→3’ et exonucléase 3’→5’ de l’ADN polymérase T4 (P7080). La polynucléotide kinase T4 (Y9040) veille à ce que les extrémités des fragments d’ADN à extrémité franche soient des extrémités 5’ phosphorylées pour la ligature à venir par ADN ligase T4.

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Ligature d’ADN

* Thermostable ; pour des applications nécessitant une ligature très rigoureuse, à température élevée, de structures d’ADN complexes.
† Thermostable ; pour une ligature de précision de cassures sans espaces ou de paires de bases mésappariées.

Clonage avec la technique SLIC

La technique SLIC exploite l’activité enzymatique exonucléase :

Clonage pour séquençage à haut débit (NGS)

Une banque destinée au séquençage à haut débit commence par un ADN fragmenté. L’action enzymatique complète les étapes du clonage.

  • icon-genomicsFragments à extrémité franche

    Les extrémités sont franches et 5’ phosphorylées avec les enzymes ADN polymérase T4, fragment de Klenow et polynucléotide kinase (PNK) T4.

  • icon-bio-informaticsQueue A aux extrémités

    Ensuite, on ajoute une queue A aux extrémités 3’ avec l’une de ces enzymes : Taq ADN polymérase ou fragment de Klenow (exonucléase 3’→5’).

  • icon-barcodeAjout d’adaptateurs

    Puis des adaptateurs complémentaires ou des codes-barres sont ajoutés par ligature avec l’enzyme finale, l’ADN ligase T4.

Tous les composants enzymatiques nécessaires à la construction de la bibliothèque d’ADN peuvent être assemblés avec des adaptateurs dans un kit de préparation « maison ».

Synthèse des gènes

La synthèse des gènes est basée sur la liaison d’oligodésoxynucléotides qui présentent de longues régions de chevauchement complémentaire.

  • icon-temperatureTaq ADN ligase thermostable

    Améliorez la synthèse en utilisant une Taq ADN ligase thermostable à la place d’une ADN ligase T4.

    Plus les températures de ligature sont élevées, plus la probabilité d’obtenir des produits de ligature corrects est importante.

  • icon-targetLigase sélective selon les cassures

     

    Utilisez une ligase sélective selon les cassures afin d’éviter les délétions dues à une ligature entre deux brèches.

    Les ADN longs synthétisés ne sont pas liés dans n’importe quel ordre.

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Questions fréquentes (FAQ) sur les enzymes pour le clonage et la recombinaison

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