Enzymes, NGS, Black male scientist looking at test-tube filled with substance in a laboratory setting
Enzimas para biología molecular

PCR y amplificación del ADN

Las Taqs prefieren el calor y a algunas les gusta desde el principio

La mayoría de las aplicaciones de amplificación in vitro utilizan una enzima termoestable para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La enzima para PCR más utilizada es la ADN Taq polimerasa. La ADN polimerasa Taq procede del Thermus aquaticus, una eubacteria extremadamente termófila que crece a temperaturas superiores a 70 °C. Esto significa que la actividad enzimática óptima de la ADN Taq polimerasa se expresa aproximadamente a 72 °C.

¿PCR estándar o hot start?

La Taq polimerasa estándar expresa una actividad óptima a 72 °C, pero la enzima se vuelve activa a partir de unos 37 °C. La actividad a baja temperatura es considerable y tiene el inconveniente de permitir amplificaciones inespecíficas y errores de cebado durante la fase inicial a baja temperatura de una reacción de PCR. Si sus necesidades incluyen la automatización de la PCR, considere la posibilidad de utilizar una Taq polimerasa hot start.

Las polimerasas hot start, a diferencia de las Taq estándar, no son reactivas a temperatura ambiente. Las técnicas de PCR de hot start siguen los mismos principios que la PCR convencional, pero se suprime la actividad enzimática hasta que se ha realizado el primer paso de desnaturalización. Esto minimiza la unión inespecífica y el cebado incorrecto y mejora la especificidad. Además, la tecnología ofrece la gran comodidad de preparar la reacción a temperatura ambiente, lo que hace posible la automatización de la PCR. En algunos casos, incluso se mejora la sensibilidad, porque la amplificación inespecífica agota los componentes de la reacción necesarios para la amplificación específica de la diana.

Todas las Taq polimerasas son adecuadas para:

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Enzimas para aplicaciones de PCR

Elija una ADN Taq polimerasa en función de sus requisitos para la PCR estándar o para una enzima de hot start adecuada para la automatización y las aplicaciones de PCR de alto rendimiento.
*La ADN polimerasa Taq Stoffel Fragment está recomendada para el genotipado y la extensión del cebador. La deleción Stoffel (exonucleasa de 5’→3’) hace que la enzima sea ligeramente más termoestable con una fidelidad algo mayor que la Taq de longitud completa y se recomienda encarecidamente para moldes de estructura secundaria y ricos en GC. En los ensayos de real-time PCR cuantitativa, las sondas de tipo TaqMan deben ser hidrolizadas durante la PCR por la actividad de nucleasa 5’ de la ADN polimerasa Taq para generar una señal. Las sondas de hibridación en los ensayos Light-Cycler no deben hidrolizarse, por lo que la precisión de las mediciones cuantitativas se mejora utilizando el Stoffel Fragment, que carece de actividad de nucleasa 5’.

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