Protocolo de PCR digital — descripción general
Preparación de las muestras — ensayo de dPCR
Pureza de la muestra
Dado que la PCR depende de varias series de reacciones enzimáticas, es más sensible a las impurezas, como las proteínas, el fenol/cloroformo, las sales y el EDTA que las reacciones catalizadas por enzimas de un solo paso. La pureza de los ácidos nucleicos es importante para la dPCR, ya que los contaminantes pueden interferir con la detección de fluorescencia.
- Los alcoholes (etanol, isopropopanol) y las sales dañan las propiedades de hibridación de los primers y las sondas así mismo, reducen la eficiencia de la amplificación, p. ej., reducción de la fluorescencia de positivos e impedimento en la discriminación de particiones positivas y negativas
- Los ácidos húmicos suprimen la fluorescencia de los colorantes de unión al ADNbc, p. ej., EvaGreen
- Las nucleasas degradan el ARN y el ADN
- La urea y el fenol desnaturalizan la taq polimerasa
- Los polisacáridos ácidos imitan los ácidos nucleicos y forman complejos de punto muerto con la taq polimerasa
A pesar de ser menos propensa a los efectos inhibitorios que la qPCR, la dPCR funciona de forma óptima con moldes de alta pureza. Existen varios kits para obtener un ácido nucleico de alta pureza y eficiencia en la PCR en función del molde, como el ADN genómico, el ADN plásmido, el ARN total, etc.
Integridad de la muestra: Longitud y secuencia
La longitud y la secuencia de los amplicones tienen tanta influencia como la pureza del molde en determinar el éxito de un experimento de dPCR. El ARN y el ADN de molde altamente degradados tienden a presentar una discrepancia entre la cantidad de ADN cuantificado por DO y el número de copias amplificadas y detectadas mediante dPCR. Se podría necesitar una cantidad de ADN mayor que la esperada para alcanzar la sensibilidad deseada (p. ej., en la detección de mutaciones). Se recomienda mantener los amplicones tan cortos como sea posible, particularmente al utilizar muestras muy degradadas (ADN de FFPE, ADN libre circulante).De forma similar, la reticulación residual puede impedir la separación y la amplificación de las hebras y los sitios abásicos pueden inducir una amplificación inespecífica. Se dispone de kits y protocolos dedicados para la recuperación de ADNg de alta calidad de muestras de FFPE.
Se recomienda usar la digestión de restricción antes del ensayo de PCR digital en cualquiera de estos casos:
- Soluciones altamente viscosas : la alta viscosidad podría disminuir la exactitud de la medición, especialmente al usar cantidades más grandes de ADN en volúmenes más pequeños. Al utilizar digestión de restricción para reducir la viscosidad, se podrían usar concentraciones de ADN mucho más altas (1 µg) en el protocolo de dPCR.
- Copias de genes ligadas o en tándem : si una división positiva contiene varias copias, las copias ligadas se contarían como una sola copia. Este problema se puede solucionar mediante el uso de digestión de restricción para separar físicamente las copias de genes a fin de segregarlas de forma independiente en las particiones.
- Plásmidos superenrollados : se recomienda la digestión de restricción para linealizar el ADN plásmido y mejorar la accesibilidad y la eficiencia de la unión del primer o la sonda al ADN. Esto mejora la exactitud de la cuantificación del plásmido.
- Moléculas grandes de ADN (>30 kb) : las moléculas más grandes de ADN podrían particionarse de manera irregular, lo que daría lugar a una sobrecuantificación de la concentración de moldes. La digestión de restricción ayuda a fragmentar los moldes grandes en tamaños más pequeños, lo que da como resultado una distribución uniforme y una cuantificación más exacta.
Cantidad de entrada de la muestra
La cantidad de entrada de las muestras depende de la tecnología de dPCR utilizada. En la PCR digital QIAcuity basada en nanoplacas, se pueden usar hasta 217.000 copias por reacción en 26k nanoplates y hasta 170.000 copias en 8.5k nanoplates.Cómo calcular el número de copias
Si se conoce el tamaño del genoma haploide de un microrganismo, la correlación entre la entrada de masa de ADN genómico (ADNg) y el número de copias resultante (para un gen de una sola copia) se puede calcular con la siguiente fórmula:
Tamaño del genoma (pares de bases) × peso medio de un par de bases único (1,096 × 10–21 g/bp).
Por ejemplo, para el genoma humano con un tamaño de genoma de aproximadamente 3,3 × 109 bp, el cálculo es el siguiente:
3,3 × 109 bp × 1,096 × 10−21 g/bp = 3,3 × 10−12 g = 3,3 pg
La tabla siguiente muestra el número de copias de 10 ng de ADNg de varios microrganismos como modelos.
| Organismo | Tamaño de genoma | Copias de genes (1 copia/genoma haploide) en 10 ng de ADNg |
|---|---|---|
| Homo sapiens | 3,3 × 109 | 3000 |
| Pez cebra | 1,7 × 109 | 5400 |
| Saccharomyces cerevisiae | 1,2 × 107 | 760.500 |
| Escherichia coli | 4,6 × 106 | 2.000.000 |
| ADN plásmido estándar | 3,5 × 103 | 2.600.000.000 |
Réplicas
Se recomienda analizar las muestras por duplicado o triplicado para evitar sesgos en la cuantificación a causa de errores de pipeteo. Al añadir los datos de los duplicados juntos, aumenta el número de eventos medidos. Esto permite aumentar la precisión del ensayo de PCR digital.
Controles
- Controles negativos:– son necesarios para supervisar las reacciones falsas positivas, que podrían surgir por la contaminación o los problemas con los primers y las sondas. Los controles negativos también se usan para determinar el límite de detección (LOD).
- Controles positivos:– se usan para comprobar si la amplificación de temperatura ocurre en las condiciones de reacción establecidas
- Controles sin molde (NTC):– Control de la contaminación en todos los reactivos
Química de detección
Cómo diseñar primers y sondas
Almacenamiento de primers y sondas
Además del cuidadoso diseño del ensayo y del uso de concentraciones de los primers y sonda adecuadas, también es fundamental el correcto almacenamiento de los primers y las sondas para que la dPCR sea exitosa.
Los primers y sondas liofilizados deben disolverse en un pequeño volumen de tampones hiposódicos, como el tampón TE a 100 µM (10 mM de Tris·Cl, 1 mM de EDTA, pH 8.0) para ofrecer una disolución madre de concentración. Como excepción, las sondas marcadas con colorantes fluorescentes Cy5 y Cy5.5 deben almacenarse en tampón TE pH 7.0 porque tienden a degradarse en un pH más elevado.
Para almacenar los primers, se pueden usar alícuotas pequeñas en tampón TE libre de nucleasas a −20 °C durante un año como mínimo. Las sondas marcadas con fluorescencia son estables en las mismas condiciones durante 6 a 9 meses. Deben evitarse los ciclos de congelación-descongelación repetidos para reducir el riesgo de degradación.
En el caso de los conjuntos de primer y sonda que se utilizan en los ensayos de dPCR múltiples, se podrían utilizar mezclas de primer-sonda 20x, con 2 primers y 1 una sonda para un elemento diana en particular en las concentraciones sugeridas.
Para reconstituir los primers y las sondas, se debe centrifugar suavemente un tubo que contiene la sonda o primer liofilizado para llevar todo el material en el fondo del tubo. El volumen necesario de tampón TE libre de nucleasas estéril debería añadirse, mezclarse y dejarse durante 20 minutos para permitir que el primer o la sonda se disuelvan por completo. La solución del primer o la sonda deben mezclarse nuevamente y la concentración debe determinarse por espectrometría. Un consejo para la resolución de problemas de dPCR es evitar disolver los primers y las sondas en agua. Algunos de estos primers y sondas tienen una solubilidad y una estabilidad más bajas en agua que en el tampón TE.
Realizar un ensayo de dPCR
Consejos para cargar muestras
El primero de los tres pasos de la reacción de dPCR es la preparación y carga de la muestra. Durante la preparación de la mezcla de PCR y la carga de la nanoplaca, se pueden tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
- Descontamine el espacio de trabajo y el equipo de laboratorio para reducir el riesgo de contaminación de ADN extraño
- Para garantizar la máxima eficiencia de la PCR, pruebe la muestra en diferentes diluciones antes del ensayo de PCR digital principal.
- Descongele por completo todos los componentes antes de preparar las mezclas de reacción y mezcle bien los componentes para obtener soluciones homogéneas y centrifugue brevemente para evitar derrames.
- Combine la mezcla maestra con la muestra, los primers, el agua libre de RNasas y las enzimas de restricción, si se utiliza alguna
- Use puntas de pipeta estériles
- Pipetee la mezcla de la reacción en la nanoplaca. Asegúrese de no introducir burbujas en los pocillos de la nanoplaca de dPCR durante la transferencia de la muestra y el transporte posterior de la placa
- Para evitar la evaporación y la contaminación, use un rodillo para sellar cuidadosamente la nanoplaca con una película.
- Transfiera la nanoplaca al instrumento de dPCR únicamente sujetando los bordes laterales de la placa, evitando agitarla o girarla para asegurarse de que la mezcla de la reacción de dPCR permanezca en el fondo de los pocillos
- Configure el software e inicie la ejecución de ensayo de dPCR
Consejos para la amplificación
El segundo de los tres pasos de reacción de dPCR es la ejecución de un protocolo de dPCR mediante amplificación. Durante este paso, la mezcla de reacción de cada pozo se separa en miles de reacciones individuales. La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador. Si hay material del molde presente dentro de una partición, se detecta una señal de fluorescencia positiva durante la adquisición de imágenes. Las imágenes se procesan con software dedicado. Generalmente, el estado de la placa actual se puede supervisar en el mismo instrumento de dPCR o utilizando el paquete de software conectado.
Los consejos para lograr condiciones de amplificación óptimas y eficiencia en la PCR incluyen:
- Temperatura de hibridación: puede influir en la especificidad del ensayo de dPCR, que suele establecerse a una temperatura de entre 55 °C y 65 °C, la temperatura de hibridación óptima se obtiene cuando se alcanza la separación máxima entre las particiones positivas y negativas; el aumento de la temperatura de hibridación podría ser beneficioso para mejorar la separación entre las señales positivas y el ruido de fondo
- Ciclos de amplificación: se recomienda ejecutar 40 ciclos de amplificación para obtener la separación suficiente entre las señales positivas y el ruido de fondo. En algunos casos, es posible que sea necesario aumentar el número de ciclos térmicos para lograr un rendimiento óptimo
Análisis de datos de PCR digital
En el último de los tres pasos de reacción de dPCR, se realiza el análisis de datos de PCR digital con cuantificación absoluta basada en las estadísticas de Poisson.
El QIAcuity Software Suite puede realizar un análisis de datos de PCR digital de acuerdo con los objetivos de aplicación: cuantificación absoluta, detección de mutaciones, edición de genomas, variación en el número de copias o expresión génica. En el análisis de cuantificación absoluta (análisis de primer nivel) el software genera un diagrama de concentración, así como una vista de particiones positivas y negativas de los pocillos seleccionados. La vista de mapa de calor muestra el canal del gen diana y el de referencia. Se pueden usar histogramas y diagramas de dispersión para cambiar los ajustes de umbral y volver a calcular los resultados. En el QIAcuity Software Suite, puede crear informes sobre los resultados del análisis de la placa. La cuantificación absoluta es el requisito previo para todos los cálculos y análisis de segundo nivel posteriores (p. ej., análisis de detección de mutaciones, análisis de expresión génica, análisis de variación en el número de copias, etc.).
Consejos para el análisis de datos de PCR digital:
- Establezca un umbral para la clasificación de particiones positivas o negativas justo por encima del grupo de particiones negativas
- Use la muestra de NTC, solamente con particiones negativas, para facilitar el ajuste del umbral, pero también realice una inspección de todos los pocillos
- Puede establecer la amplitud de fluorescencia de los pocillos individuales ligeramente por encima o por debajo de los NTC para evitar la clasificación incorrecta de algunas particiones
- Aunque no existe consenso en cuanto al valor, normalmente se considera que una reacción es positiva cuando el número de particiones positivas es superior a 2
- Para abordar la variabilidad entre pocillos y entre lotes, use el factor de precisión de volumen (Volume precision factor, VPF) para definir el volumen exacto de cada pocillo y aplicar el factor en los cálculos de concentración por medio del software
Ejemplos de datos de PCR digital
Directrices digitales MIQE (dMIQE)
Los puntos de la lista de comprobación de las directrices dMIQE se consideran fundamentales para notificar cuándo publicar los resultados de dPCR. La información que debe informarse incluye, pero no se limita a:
- Media de copias de elementos diana de ADN por partición (λ)
-
Número de particiones utilizadas (junto con la media de copias de elementos diana de ADN, estos valores pueden determinar la precisión del ensayo de dPCR)
-
Información estructural del molde, ya que la naturaleza de la muestra podría afectar la exactitud y fiabilidad de los datos:
- Tipo de molde para partición individual: genómico, plasmídico, etc.
- Origen: microrganismo, tejido, célula, alimento, planta, etc.
- Tratamiento: Digestión de restricción, sonicación, preamplificación, dilución, ninguno
- Volumen de la partición individual, ya que este volumen podría variar entre las plataformas de dPCR
- Volumen total de reacción, que se puede calcular multiplicando el número de particiones por el volumen de partición.
- Tipos de controles utilizados
- Gráficos de amplificación o valores de fluorescencia convencional representativos de datos experimentales positivos y negativos
- Ejemplo de varianza experimental, preferentemente de múltiples réplicas biológicas para capturar con mayor exactitud la incertidumbre experimental
- Otros
Cómo transferir y optimizar los ensayos de qPCR a dPCR
Parámetros de optimización del ensayo de dPCR
| Condición | Efecto variable sobre | Intervalo |
|---|---|---|
| Temperatura de hibridación | •Especificidad •Separación de particiones positivas y negativas •Artefactos del ensayo |
•Teórico u operativo Ta +/– 2,5 ºC |
| Concentración de primer/sonda | •Separación de particiones positivas y negativas (aumento de la señal positiva o disminución de la señal negativa) |
•0,8 µm de primer; 0,4 µm de sonda (punto de inicio) |
| Pasos del termociclado | •Eliminación de la señal de división intermedia | •2 o 3 (inclusión de elongación de 72 ºC) |
| Número de repeticiones de ciclos térmicos | •Eliminación de la señal de división intermedia | •30-60 repeticiones |
Sin embargo, al incorporar un nuevo ensayo, siempre se recomienda una prueba piloto inicial para evaluar el rendimiento. También se aconseja usar controles debidamente caracterizados y representativos en una matriz de fondo adecuada. El ensayo debe optimizarse para garantizar la exactitud analítica si el rendimiento es subóptimo. En tal caso, los detalles de los informes del proceso de optimización resultan fundamentales para la reproducibilidad.
Para la optimización rápida de los ensayos subóptimos, al ejecutar un gradiente térmico durante los pasos de hibridación, las mezclas maestras de QIAcuity también pueden ejecutarse en cualquier instrumento de real-time PCR.
Resolución de problemas de PCR digital
Los experimentos de dPCR pueden verse afectados por problemas similares a los de las qPCR o las PCR tradicionales o convencionales. Sin embargo, podrían surgir ciertas dificultades específicas al realizar un ensayo de PCR digital. La tabla siguiente sirve como una guía de resolución de problemas de dPCR para situaciones que suelen encontrarse en un protocolo de dPCR típico, en la que se indican las posibles causas y las recomendaciones de nuestros expertos.
| Problema | Posibles causas | Nuestras recomendaciones |
|---|---|---|
| Sin particiones negativas | Si los pocillos de NTC tienen particiones negativas: La concentración de elementos diana de la muestra es demasiado alta |
Ejecute una serie de diluciones para determinar la cantidad óptima de ADN de entrada. |
| Si los pocillos de NTC solo tienen particiones positivas: Hidrólisis de la sonda producto de un almacenamiento deficiente a largo plazo de la disolución madre de la sonda o de la escisión prematura de la sonda por acción de la polimerasa |
Vuelva a ordenar una sonda y prepare una nueva solución madre de la nueva sonda o identifique las interacciones intraanalíticas, rediseñe los componentes del ensayo de dPCR para reducir la unión y la escisión. |
|
| Sin particiones positivas | La enzima de restricción podría haber cortado dentro de la secuencia diana |
Pruebe el ensayo de dPCR con el ADN digerido con otra enzima de restricción y ADN sin digerir |
| La secuencia diana es parte de una estructura secundaria o contiene bucles, repeticiones, alto contenido de G/C |
Modifique el diseño para otra diana, use una enzima de restricción para fragmentar ADN de inicio (sin cortar la propia secuencia diana) |
|
| Las condiciones de amplificación no son óptimas. | Ejecute un gradiente de temperatura de hibridación/extensión para determinar la temperatura óptima del protocolo de PCR digital; ajuste los parámetros físicos (elongación, tiempo, etc.) |
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| Inhibición de dPCR parcial | Cambie el método/kit de purificación de ácidos nucleicos; considere la adición de un potencializador, como BSA |
|
| Los primers o las sondas no coinciden con la región de interés como se prevé. |
Asegúrese de que no se cometan errores durante el diseño del ensayo de dPCR o la síntesis de primers/sondas |
|
| Señal positiva de los pocillos de NTC | Contaminación con molde/amplicón en los reactivos |
Limpie las pipetas, las cajas de puntas y la superficie de las mesas del laboratorio con lejía al 5-10 %; prepare las muestras y realice la dPCR en distintas habitaciones; use equipo de protección individual adecuado; las mezclas que contienen dUTP junto con uracilo N-glicosilasa (UNG) termolábil podrían reducir el número de falsos positivos que surgen de productos de PCR contaminantes, pero no tienen efecto sobre los contaminantes que se originan en el molde |
| Escasa cantidad de positivos | Purificación del ADN deficiente | Use únicamente ADN purificado; pruebe un método/kit de purificación alternativo |
| Carga de muestras o nanoplacas inadecuada | No cargue en exceso ni de forma insuficiente el ADN de la muestra; pipetee con cuidado, asegúrese de que se haya transferido toda la mezcla de dPCR a la nanoplaca; asegúrese de que la muestra se mantenga en el fondo de los pocillos de entrada |
|
| Concentración del primer incorrecta | Use las concentraciones de primer y sonda recomendadas | |
| Evaporación de la nanoplaca durante la amplificación |
Selle cuidadosamente la nanoplaca (también alrededor de los bordes) con el rodillo y la película | |
| Burbujas en los pocillos; | Pipetee con cuidado; transporte la nanoplaca sujetándola por los bordes laterales solamente; no deje caer ni invierta la nanoplaca |
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| Alteración o transferencia inadecuada de las muestras a la nanoplaca (por lo que no toda la muestra se acumula en el fondo de los pocillos de entrada) |
||
| No hay una separación clara entre particiones positivas y negativas |
Condiciones de amplificación subóptimas | Aumente el número de ciclos (pero no supere los 50 ciclos); aumente el tiempo de elongación a 2 minutos, el tiempo de desnaturalización a 1 minuto (es especialmente importante para los amplicones más largos); realice diluciones seriales para determinar la cantidad óptima de ADN de entrada |
| Incapacidad para separar partiicones positivas y negativas al trabajar con EvaGreen |
Cantidad excesiva de primer o material inicial de ADN |
Use los primers en las concentraciones recomendadas; no sobrecargue el material de inicio |
| La longitud del fragmento es demasiado larga | Homogeneice la longitud del fragmento mediante digestión de restricción | |
| Aparición de “ruido” de fondo (partiiciones que no pertenecen a la población de positivos y negativos) |
Unión no específica | No sobrecargue los primers; trate de aumentar la temperatura de hibridación, reduciendo el número de ciclos y el tiempo de extensión e hibridación; asegúrese de que los reactivos no contengan impurezas |
| Escaso acceso al elemento diana | Use digestión de restricción (evite cortar la secuencia diana) o sonicación; para tratar estructuras de ARN secundarias: intente cambiar la ubicación del elemento diana o realice una transcripción inversa a temperaturas más elevadas |
|
| Inicio tardío de la PCR debido a la inhibición parcial de algunas particiones |
Reduzca la cantidad de muestra cargada; diluya la muestra aún más; cambie el método o el kit para purificación de ácidos nucleicos |
|
| Aparición de ruido (grupos de puntos negativos por encima del umbral) |
Contaminantes sólidos o burbujas | Extreme las precauciones al preparar las nanoplacas; examine el manual de resultados para darles sentido si es posible |
| Problemas ópticos con el instrumento | Asegúrese de que el sistema de dPCR cuente con una tecnología óptica superior con alta estabilidad óptica |
|
| Aparición de un grupo extra inesperado |
Una variante de secuencia del elemento diana de interés |
Si el grupo inesperado no es deseable: ajuste el umbral por encima del grupo para excluirlo de la cuantificación, aumente la temperatura de hibridación para mejorar la especificidad, realice la digestión con una enzima de restricción para cortar el elemento diana inespecífico, modifique el diseño del primer o la sonda para reducir la complementariedad con la secuencia colateral; si el grupo representa un posible homólogo funcional, considere bajar la temperatura de hibridación para que los dos grupos se fusionen en un solo grupo |
| No hay medición de concentración en algunos pocillos |
Problema con el ensamblaje de mezcla de reacción o preparación de las muestras |
Asegúrese de que el ensayo de dPCR está correctamente preparado y que la entrada y la pureza de ADN son satisfactorias |
| Manipulación deficiente de la nanoplaca durante el transporte (agitación, caída) |
Extreme las precauciones durante la preparación de las muestras, el pipeteado de la mezcla de reacción de dPCR en la nanoplaca, manipule la nanoplaca únicamente por los bordes laterales y evite invertirla, agitarla y dejarla caer antes de cargarla en el sistema de dPCR; si es posible, establezca manualmente un umbral en el software para calcular una concentración determinada |
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| Sellado incorrecto de la placa (evaporación desde los laterales) |
Selle cuidadosamente la placa con película utilizando el rodillo | |
| Las concentraciones medidas son demasiado bajas | Diseño de ensayo de dPCR deficiente | Realice un experimento de gradiente de temperatura para asegurarse de que el ensayo de dPCR se esté ejecutando en condiciones óptimas; verifique que el fluoróforo no esté conjugado a un residuo G; añada primers y sondas en las concentraciones recomendadas |
| Escaso acceso al elemento diana | Use digestión de restricción (evite cortar la secuencia diana) o sonicación |
|
| Presencia de inhibidores de PCR en las muestras | Cambie el método/kit de purificación de ácidos nucleicos; añada un potencializador, como BSA |
|
| Barras de error de gran tamaño (resultados incosistentes) | Mezclado deficiente de las mezclas de reacción | Mezcle bien las mezclas de reacción |
| Problemas con la uniformidad de la temperatura del termociclador |
Aumente la temperatura de desnaturalización de 94 a 96 °C para los primeros cinco ciclos |
Más soporte con la optimización de dPCR
Referencias
Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)
Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.
QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.
Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.
Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023.
The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.