Alles rund um die RNA: Amplifikation, Sequenzierung, Ligation, Markierung
RNA durch Amplifikation nachweisen und bearbeiten
Reverse Transkriptasen sind Enzyme, die einen DNA-Strang (cDNA) polymerisieren können, der komplementär zu einem ursprünglichen RNA-Template ist. RNA ist anfällig für den Abbau durch RNasen. Der Einsatz eines Reverse-Transkriptase-Enzyms zur Herstellung von cDNA überwindet die Probleme bei der Arbeit mit mRNA. Die cDNA wird zum stabilen Template für eine Vielzahl von nachgeschalteten Anwendungen für RNA-Untersuchungen, wie beispielsweise für die Analyse der Genexpression. Für die Amplifikation des cDNA-Templates können reguläre PCR-, qPCR-, einstufige RT-qPCR- oder isotherme Verfahren genutzt werden. Nach der Amplifikation kann die Klonierung mit herkömmlichen Enzymprotokollen oder durch ligationsunabhängige Klonierung unter Nutzung der 3’→5’-Exonukleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase erfolgen.
Alle Reverse-Transkriptase-Enzyme (RNA-abhängige DNA-Polymerasen) können wie nachstehend genannt eingesetzt werden:
Reverse Transkriptasen
Wählen Sie ein Reverse-Transkriptase-Enzym oder -Kit, das den Anforderungen Ihres RNA-Templates oder Ihrer RNA-Applikation entspricht.
RNA-Polymerasen und -Ligasen
RNA-Polymerasen, genauer gesagt DNA-abhängige RNA-Polymerasen, sind Enzyme, die RNA anhand eines DNA-Templates synthetisieren. Das Enzym Poly(A)-Polymerase verwendet einzelsträngige RNA als Primer, um an die RNA einen Poly(A)-Schwanz anzufügen, indem es den Einbau von Adenin-Resten am 3’-Ende von RNA katalysiert.
T4-RNA-Ligasen sind nützliche Enzyme für die RNA-Analyse, insbesondere, wenn sie Verfahren wie Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und Microarrays vorgelagert werden. Die T4-RNA-Ligasen 1 und 2 sind Enzyme, die eine Markierung, Zirkularisierung oder intermolekulare Ligation von RNA durchführen können, indem sie benachbarte 3'-OH- und 5'-PO4-Polynukleotide verbinden. Das Anbringen von Adaptern am 3'-Ende von RNA mit T4-RNA-Ligase 1 ist ein nützlicher erster Schritt für die RNA-Quantifizierung und -Charakterisierung mittels RT-PCR und Hochdurchsatzsequenzierung.
Mit diesen Polymerasen und Ligasen wird die Manipulation von RNA ganz einfach.
RNA-Verdau und -Schutz
Der Ribonuklease-Schutzassay (Ribonuclease protection assay, RPA) mit dem Enzym RNase A ist eine Technik, mit deren Hilfe die relative oder absolute Transkriptabundanz bestimmt und die mRNA-Enden sowie Intron-/Exon-Grenzen kartiert werden können.
Einzelbasensubstitutionen können anhand einer einfachen enzymatischen Methode erkannt und lokalisiert werden, bei der Einzelbasen-Fehlpaarungen in RNA:DNA-Heteroduplizes durch RNase A gespalten werden.
Entdecken Sie die vorgestellten Enzyme für die RNA-Analyse
Häufige Fragen zur RNA-Analyse
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