Der neue Standard in der PCR – Digitale PCR

Die Kraft der digitalen PCR – Die Nadel im Heuhaufen finden

Bei der digitalen PCR (dPCR) erfolgt eine Partitionierung der Probe auf viele einzelne Reaktionen, damit entweder null, ein oder mehrere Zielmoleküle in jeder Reaktion vorhanden sind. Mit diesem Ansatz wird es erstaunlich einfach, ein positives Signal vor einem starken Hintergrund aus negativen Signalen nachzuweisen – die typische Suche nach der Nadel im Heuhaufen. In derartigen Fällen schließt die untere Nachweisgrenze die herkömmliche quantitative Real-time PCR (qPCR) als brauchbare Methode aus.

Das bestimmende Merkmal der digitalen PCR ist die absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren. Nach der Partitionierung durchlaufen die Reaktionen ein Endpunkt-PCR-Thermocycling. Die Partitionen werden dann auf die Anwesenheit (positive Reaktion) oder die Abwesenheit (negative Reaktion) eines Fluoreszenzsignals hin analysiert. Basierend auf dieser Information lässt sich die absolute Zahl der in der Probe vorhandenen Moleküle berechnen. Im Unterschied zur qPCR benötigt man bei der dPCR keine Standardkurven. Dadurch hat die dPCR eine niedrigere Nachweisgrenze und eine höhere Präzision als die qPCR.

Forschende nutzen die digitale PCR zunehmend für sensitive Anwendungen, wie die Analyse von Kopienzahlvariationen, die Quantifizierung der Genexpression und den Nachweis seltener Targets. Die Methode hat zu Fortschritten bei Zell- und Gentherapieforschung, Krebsforschung, Überwachung von Infektionskrankheiten, Lebensmittelüberprüfung und vielem mehr geführt.

Die Magie im Inneren enthüllen

Methoden der Probenpartitionierung für die digitale PCR umfassen unter anderem mikrofluidische Chips, Mikroarrays, Spinnen von mikrofluidischen Scheiben und Tröpfchentechniken mit Öl-Wasser-Emulsionen. Durch Neugestaltung einer vertrauten Lösung mit besserer Benutzerfreundlichkeit und höherer Auflösung haben wir mikrofluidische Nanoplatten entwickelt, die eine herausragende Partitionierung und bessere Daten der digitalen PCR ermöglichen.

Keine Tröpfchen. Keine Kristalle. Keine Chips.

Zu den wesentlichen Vorteilen der Durchführung der digitalen PCR in Nanoplatten zählen u. a.:

• Benutzerfreundliche, vertraute Platten mit einfacher Pipettierung wie bei der qPCR
• Feste Partitionen, die Variationen bei Größe und Koaleszenz verhindern
• Versiegelte Nanoplatten, die Kontaminationen von Well zu Well verhindern
• Möglichkeit schnellerer Readouts durch gleichzeitiges Auslesen aller Partitionen einer Probe
• Integrierte Qualitätskontrolle, d. h. Möglichkeit, anhand der Anzahl einzelner positiver Partitionen auf dem Plattenbild einzelne Fluoreszenzsignale zu suchen
• Eignung der Platten für die Front-End-Automation

Vorteile gegenüber der tröpfchenbasierten digitalen PCR-Technologie (ddPCR)

Neben den oben genannten Punkten bietet das Nanoplatten-basierte QIAcuity Digital PCR System weitere signifikante Vorteile gegenüber der tröpfchenbasierten digitalen PCR (ddPCR).

Der gesamte digitale PCR-Workflow ist in einem System integriert. Dadurch wird der Arbeitsablauf schneller und lässt sich mit weniger manuellen Handgriffen und höherer Skalierbarkeit durchführen.

Lesen Sie mehr über dPCR vs. ddPCR