Enzymes, NGS, Black male scientist looking at test-tube filled with substance in a laboratory setting
Enzyme für die Molekularbiologie

PCR und DNA-Amplifikation

Taqs mögen es heiß und manche mögen es von Anfang an heiß

Die meisten Anwendungen im Bereich der In-vitro-Amplifikation arbeiten mit einem thermostabilen Enzym für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Das am häufigsten verwendete PCR-Enzym ist die Taq-DNA-Polymerase. Die Taq-DNA-Polymerase stammt aus Thermus aquaticus, einem äußerst thermophilen Eubakterium, das bei Temperaturen über 70 °C wächst. Das bedeutet, dass die optimale Enzymaktivität der Taq-DNA-Polymerase bei etwa 72 °C erreicht wird. 

Standard-PCR oder Hot-Start-PCR?

Die Standard-Taq-Polymerase entfaltet ihre optimale Aktivität bei 72 °C, doch aktiv wird das Enzym schon ab etwa 37 °C. Die Aktivität bei niedrigeren Temperaturen ist beträchtlich und hat den Nachteil, dass sie unspezifische Amplifikationen und Mispriming-Ereignisse während der anfänglichen Niedrigtemperaturphase einer PCR-Reaktion zulässt. Für eine automatisierte PCR sollten Sie eine Hot-Start-Taq-Polymerase verwenden.

Hot-Start-Polymerasen sind, anders als die Standard-Taq, bei Raumtemperatur nicht reaktiv. Hot-Start-PCR-Techniken folgen dem gleichen Prinzip wie die konventionelle PCR, mit dem Unterschied, dass die Enzymaktivität unterdrückt wird, bis der erste Denaturierungsschritt abgeschlossen ist. Dies minimiert unspezifische Bindungen und Fehlpriming, wodurch die Spezifität verbessert wird. Darüber hinaus bietet diese Technik den großen Vorteil, dass die Reaktionen bei Raumtemperatur angesetzt werden können, was eine Automatisierung der PCR ermöglicht. In einigen Fällen verbessert sich sogar die Sensitivität, da durch die unspezifische Amplifikation die für die spezifische Zielamplifikation erforderlichen Reaktionskomponenten verbraucht werden.

Alle Taq-Polymerasen eignen sich für:

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Enzyme für PCR-Applikationen

Wählen Sie je nach Ihren Anforderungen eine Taq-DNA-Polymerase für die Standard-PCR oder ein Hot-Start-Enzym für die Automatisierung und für PCR-Anwendungen mit hohem Durchsatz.
* Für Genotypisierung und Primer-Extension wird die Stoffel-Fragment Taq-DNA-Polymerase empfohlen. Die Stoffel-Deletion (5’→3’-exo-) macht das Enzym etwas thermostabiler, erhöht die Genauigkeit leicht im Vergleich zur Volllängen-Taq und wird dringend für GC-reiche Templates sowie Templates mit Sekundärstrukturen empfohlen. Bei quantitativen Real-time-PCR-Assays müssen Taq-Man-Sonden während der PCR durch die 5'-Nukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase hydrolysiert werden, um ein Signal zu erzeugen. Die Hybridisierungssonden in Light-Cycler-Assays dürfen nicht hydrolysiert werden. Daher verbessert sich die Genauigkeit der quantitativen Messungen bei Einsatz des Stoffel-Fragments, dem die 5'-Nukleaseaktivität fehlt.

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