dPCR für Anfänger

Entwicklung der dPCR

Die komplexen Forschungsfragen von heute erfordern eine Informationstiefe, die über die Kapazität traditioneller PCR-Technologien hinausgeht. Die digitale PCR der dritten Generation verkleinert diese Lücke und ist eine wesentlich simplere und praxistauglichere Technik, um diese alltäglichen Forschungsfragen zu klären.

Das technische Konzept der digitalen PCR wurde etwa 1992 entwickelt, als Sykes et al. es als „PCR mit limitierender Verdünnung“ beschrieben. Bei dieser allgemeinen Methode wurde mithilfe von Endpunktanalyse und Poisson-Statistik die absolute Zahl von in einer Probe vorliegenden Nukleinsäuremolekülen quantifiziert. 1999 folgte die revolutionäre Arbeit von Vogelstein und Kinzler, welche eine Methode entwickelten, bei der die Probe verdünnt und auf einzelne, Partitionen genannte Reaktionen aufgeteilt wurde. Nach der Amplifikation erfolgten Nachweis und Analyse einzelner Produkte mit Fluoreszenzsignal. Sie prägten dann den Begriff „digitale PCR“, so wie wir ihn heute alle kennen.

Im Laufe der Jahre wurden diese Methoden weiterentwickelt und für eine breitere Anwendung kommerzialisiert. Die digitale PCR kann auf Mikrofluidik-Chips und -Tellern, auf Microarrays und in Mikrotröpfchen oder Tröpfchenkristallen auf Basis von Öl-Wasser-Emulsionen sowie neuerdings auch in qPCR-artigen Platten durchgeführt werden.

Sie suchen noch immer nach Antworten auf die Frage, was digitale PCR ist? Lesen Sie unseren Bench Guide, um mehr über die Grundlagen, Vorteile, Grenzen und Anwendungen der digitalen PCR zu erfahren.

Die digitale PCR ermöglicht die absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren, ohne dass Referenzen oder Standardkurven notwendig sind. Die Methode, bei der die Probe in Tausende von Einzelreaktionen aufgeteilt wird, zeichnet sich durch hohe Toleranz gegenüber Inhibitoren, überlegene Genauigkeit, erhöhte Sensitivität und hohe Reproduzierbarkeit aus. Aufgrund dieser Merkmale verwenden immer mehr Forschende zur Analyse der Kopienzahlvariation, zum Nachweis seltener Mutationen, zur Ermittlung der Viruslast, zur Genexpressionsanalyse, zur Quantifizierung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken und für andere Anwendungen die digitale PCR.

Teilen und gewinnen

Zwar wird die Probe genauso vorbereitet wie bei der qPCR, doch die Probenpartitionierung, bei der die Probe vor der Amplifikation in Tausende von Einzelreaktionen aufgeteilt wurde, ist ein Alleinstellungsmerkmal der digitalen PCR. Anders als bei der Massenanalyse in der qPCR wird bei der digitalen PCR durch zufällige Aufteilung der Moleküle in Partitionen der Effekt konkurrierender Targets minimiert, während zugleich die Präzision und Sensitivität des Nachweises seltener Targets steigen.

Sie erlaubt Forschern:

• Die Quantifizierung in geringer Menge vorliegender Targets oder von Targets mit komplexem Hintergrund
• Den Nachweis und die Unterscheidung von Allelvarianten (SNPs)
• Die Überwachung geringfügiger Veränderungen der Target-Konzentration, die mittels qPCR nicht nachweisbar wären

Das Poissonsche Gesetz gibt der Partitionierung einen Sinn

Anders als die Real-time qPCR ist die digitale PCR nicht davon abhängig, dass in jedem Amplifikationszyklus die relative Menge an Target-Molekül bestimmt wird; stattdessen verlässt sie sich auf die Poisson-Statistik zur Bestimmung der absoluten Target-Menge im Anschluss an eine Endpunkt-Amplifikation.

Da das Target-Molekül zufällig über alle verfügbaren Partitionen verteilt ist, schätzt die Poisson-Verteilung die durchschnittliche Anzahl der Moleküle pro Partition (null, eins oder mehr) und berechnet die Kopien des Target-Moleküls pro positiver Partition. Die statistische Poisson-Analyse der Anzahl positiver und negativer Reaktionen ermöglicht eine präzise, absolute Quantifizierung der Zielsequenz.