Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• 通过一次扩增获得最庞大的既有 STR 组合
• 符合欧洲/SWGDAM 最小 Y 单倍型、CODIS、国际刑警组织和 ESS 的要求
• 从低输入量的 gDNA 中获得完整的图谱
• 从具有挑战性的样本中检测等位基因，具有出色的平衡性，并且检出率高
• 每次运行最多同时测序 96 个样本
• 获准上传到美国国家 DNA 索引系统（National DNA Index System，NDIS）用于案件工作（SE 不可）

通过 ForenSeq MainstAY 产品线靶向核心常染色体和 Y-STR，这是为主流案件工作和鉴证遗传谱系学确认性测试生成易辨别数据的最便捷方法。可以在两个地理相关选项之间进行选择，比如可以选择经 NDIS 批准的 ForenSeq MainstAY Kit，它专为支持大多数国家数据库 STR 上传而设计，或者选择 ForenSeq MainstAY SE Kit，它包含高多态性的 SE33 标记基因。MainstAY 产品专注于常规人类身份鉴定应用中使用的成熟 STR，并保持与全球数据库的兼容性，从而简化了向下一代测序的过渡。熟悉且成熟可靠的 ForenSeq 工作流程可为多达 96 个证据样本生成更全面的 DNA 图谱，手动操作时间不到 2 小时。

ForenSeq MainstAY 为将下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）纳入您的操作工作流程提供了一个简易的过渡点。NGS 支持在单次反应中同时对不同类别的 STR 进行分型，从而从鉴证样本中回收最多信息。NGS 还将 STR 的鉴别力与额外的序列级变异相结合，可以解决 STR 内的等位基因问题。ForenSeq MainstAY Kit 包含的试剂可将 27 种常染色体位点和 25 种 Y-STR 位点扩增为小扩增子，并使用 MiSeq FGx Reagent Micro Kit 在 MiSeq FGx Sequencing System 上生成测序数据。采用这种工作流程，一次扩增就能同时鉴定 Au-STR 和 Y- STR 中的序列和等位基因长度多态性。这样就无需运行多个工作流程，可最大限度地提高鉴证样本的信息价值，从而提高纳入样本的统计功效。NGS 还消除了等位基因重叠问题，让用户可以在多重扩增中检测更多等位基因。

• STR 位点与釉原蛋白相结合可成为人类身份鉴定的有效工具
• 与全球现有数据库保持兼容
• 推荐的 1 ng gDNA 低输入量可带来可重现的高检出率
• 使用 MainstAY 分析模块，在熟悉易用的界面上分析序列数据
• 在 1.5 天内生成报告

与大多数市售的常染色体 STR 试剂盒相比，由于可在单次反应中包括 27 种 Au-STR、25 种 Y-STR 和釉原蛋白，可达到更高的预期似然比，并可直接比较单一来源的图谱（例如，通过数据库搜索和国际数据共享），而无需考虑用于比较样本分型的检测。ForenSeq MainstAY 所生成的基因图谱可通过 Au-STR 进行案件工作搜索，以及通过 Y-STR 数据库进行单倍型搜索。Y-STR 可生成男性 DNA 的单倍型图谱，因此在处理男性/女性混合物时极有帮助。在只有一名男性贡献者的情况下，它可以用来排除潜在的男性贡献者。

可同时测序的最大文库数取决于每个位点所需的读数量或覆盖深度（Depth of Coverage，DoC）。各扩增子的均衡读数覆盖率对位点和等位基因的回收率也至关重要。ForenSeq MainstAY Kit 在一次测序反应中多重扩增了少量标记基因，因此总体覆盖率较高。使用 MainstAY 文库测定了来自 46 个男性 Coriell 样本（包括一个阳性扩增对照）、49 个女性 Coriell 样本和一个 NTC 的 1 ng 输入量 DNA 的位点间平衡。男性样本 Au-STR 和 Y-STR 的平均覆盖率分别为 669 和 469 个读数。女性样本 Au-STR 的平均覆盖率为 1065 个读数。覆盖深度最高和最低的 Au-STR 之间的倍数差为 15 倍，而读数最高和最低的 Y-STR 之间的倍数差为 4.6 倍（见图“ForenSeq MainstAY Kit 所含标记基因的平均 DoC”）。以读数总量占比表示的男性样本中位位点间平衡为 1.9%（Au-STR：2.2%，Y-STR：1.6%）。对于女性样本，Au-STR 的位点间平衡为 3.7%（见图“ForenSeq MainstAY Kit 所含遗传标记基因的位点间平衡”）。

位点内平衡（IntraLocus Balance，ILB）或称杂合平衡（Heterozygous Balance，HB）是杂合子对较低的等位基因读数量与较高的等位基因读数量的比值。与基于 CE 的 STR 相比，由于文库制备和测序过程中较小扩增子的扩增偏差，NGS 显示的 ILB 范围更大。本研究使用 1 ng 的 DNA 样本对每个样本和位点的杂合子和等位基因型对的 ILB 进行了评估。组合中所有标记基因的 ILB 值均高于 60%，中位 ILB 值为 86%。ForenSeq MainstAY Kit 的覆盖率和低变异表明，扩增子具有良好的平衡性，从而降低了位点或等位基因脱扣的可能性，并提高了对混合物中次要贡献者的鉴定能力（见图“1 ng DNA 输入量下 ForenSeq MainstAY Kit 中基因标记的位点内平衡”）。

使用一式三份模板量为 1 ng、500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg、15.625 pg 和 7.82 pg 的连续稀释 gDNA 评估了在一系列输入量下生成基因型和单倍型的能力。使用 MiSeq FGx Reagent Micro Kit 同时对 96 个文库进行了测序。ForenSeq MainstAY Kit 灵敏度高，在对 96 个文库同时测序时，只需 62.5 pg 输入量的 DNA 就能生成完整的图谱（无等位基因丢失）和 100% 的检出率。为了确定等位基因的检出率和基于测序的基因型数据的比较准确性，使用 Universal Analysis Software 中的 MainstAY 分析模块，按照默认设置生成了基因型和单倍型，并与传统基因分型方法（STR 的 CE 片段长度检测）的常规标准基因分型数据进行了比较。Au-STR 在输入量降至 62.5 pg 时表现出的一致率为 100%，在 31 pg 下的一致率为 95%。Y-STR 在输入量降至 125 pg 时表现出的一致率为 100%，在 31 pg 下的一致率为 91%。所有不一致的鉴定都是由于滑移超过了为 1 ng 样本设置的默认滑移过滤器设置值所致。（见图“使用一式三份扩增的连续稀释 gDNA 样本进行的灵敏度研究”）。

为了评估 ForenSeq MainstAY Kit 生成的基因型和单倍型的一致性，制备了 31 个文库，其中包括 NIST SRM 2391d 标样、Coriell DNA、一个阳性扩增对照和三个 NTC，并进行了一式三份的测序。使用 Universal Analysis Software 中的 MainstAY 分析模块在默认分析阈值和滑移过滤器下分析了数据。通过与常规标准 CE 数据比较，确定了基因型和单倍型等位基因的准确性。通过重复性和重现性实验确定了精确度和检出率，在实验中，三名操作员在三台不同的 MiSeq FGx 仪器上对 15 个对照 DNA 样本进行了一式四份的文库制备和测序，其中包括一份阳性扩增对照和三个 NTC。结果表明，Au-STR 和 Y-STR 的准确率都很高，分别达到 99.82% 和 100%。在 3261 个 Au-STR 等位基因中检测到 6 个不一致的等位基因。在 774 个 Y-STR 等位基因中未检测到不一致的等位基因。Au-STR 和 Y-STR 的精确率也都很高，分别达到 99.87% 和 99.42%。所有差异都是由于滑移等位基因超出了默认的滑移过滤阈值。

为了评估 ForenSeq MainstAY Kit 检测低水平贡献者中次要等位基因的能力，在 1 ng 下生成了女性和男性对照样本的混合物，其中女性样本为主要贡献者。次要贡献者在混合物中的比例从 50% 到 0.2% 不等。使用 Universal Analysis Software 的 MainstAY 分析模块中的默认分析和解读阈值以及滑移过滤器，评估了混合物中唯一、未共享次要等位基因贡献者等位基因的数量（见图“次要贡献者连续稀释水平下女性:男性 gDNA 对照样本的混合物”）。在 50% 的次要贡献者下，检测到 31 种唯一的常染色体次要等位基因和 27 种 Y 等位基因。当次要贡献率为 5% 时，可检测到约 15 种唯一的常染色体次要常染色体等位基因（50% 唯一的 Au-STR 等位基因）和 26 种 Y 等位基因。次要贡献率为 1% 时，可检测到超过 10 种 Y-STR 位点。ForenSeq MainstAY 能够高效鉴定混合物中的次要贡献者，哪怕其贡献率较低。

使用模拟暴露在环境和化学压力下的鉴证样本的部分降解 gDNA 评估了 ForenSeq MainstAY 工作流程对已降解 DNA 样本进行基因型和单倍型分型的能力。使用 Miseq FGx Reagent Micro Kit 对来自 30 个样本的 1 ng 降解血液、1 个阳性扩增对照和 NTC 的文库进行了一式三份的制备和测序。利用降解指数（Degradation Index，DI）对文库的样本质量进行了评估。DI 值为 1 至 4 的样本未降解，DI 值为 4 至 10 的样本中度降解，DI 值大于 10 的样本严重降解。用 MainstAY 检测的样本 DI 值从 1 到 56 不等，覆盖了低度、中度和高度降解样本。在没有降解的样本中，所有 STR 都能准确分型。中度降解的样本中，可准确分型的 STR 的检出率大于 85%，而严重降解的样本中，检出率大于 71%，这表明可扩增 STR 的损失极小。DI 值最高的 56 个样本的等位基因回收率为 60%（74 个样本中回收了 40 个）。ForenSeq MainstAY 甚至能从严重降解的样本中检测到大量等位基因（见图“从降解血液样本中提取的基因组 DNA”）。

ForenSeq MainstAY 工作流程建立在熟悉的 ForenSeq 化学试剂基础之上，后者是 Verogen 文库制备产品组合的基础。这种基于 PCR 的灵敏检测能高效扩增 53 种标记基因，并集成了唯一双index（Unique Dual Indices，UDI），产生的短扩增子能提高从降解 DNA 中检测到等位基因的可能性。8 μl 的 DNA 提取输入量有助于灵活支持低浓度样本和稀释含抑制剂的样本。

该全套解决方案包括一个阳性扩增对照，以方便购买和校准。该试剂盒可以利用 MiSeq FGx Sequencing System 的长双端读取能力，在 MiSeq FGx Reagent Micro Kit 上对多达 96 个样本进行测序和分析，从而最大限度地提高样本通量并降低单位样本的成本。1 ng 的推荐低 gDNA 输入量可在从高质量单一来源样本直至 62.5 pg 低输入量和疑难样本的范围内以可靠且可重现的方式恢复完整的图谱。

ForenSeq MainstAY Kit 与 MiSeq Fgx Sequencing System、MiSeq FGx Reagent Micro Kit 以及 Universal Analysis Software (UAS) 中的 MainstAY 分析模块配合使用时，可在 30 小时内完成端到端工作流程。MainstAY 分析模块提供引导式探索、提供项目和样本视图的丰富可视化功能，并通过丰富的过滤和排序功能对 STR 等位基因鉴定进行细致的审查。它还能生成可导出为多种格式的人类可读报告。该集成工作流程为考虑将 NGS 用于法医应用的实验室提供了高性价比的切入点。

该工作流程包括五个安全停止点和一个用于提高文库制备效率和简便性的预混接头板。该工作流程与各种常见的法医 DNA 来源兼容，如提取的 gDNA、原始裂解物和存储介质卡打孔（如 FTA）。

• 对大量案件工作进行集中和高效的分析

同时检测多达 96 个样本的最庞大特征明确基因位点，包括 27 种常染色体 STR 和 25 种 Y-STR 标记基因。只需低至 100 pg 的输入量即可生成与所有现有 STR 数据库兼容的平衡图谱。使用极简相互作用分析模块高效分析数据，并从一系列可上传的导出选项中进行选择，以满足地区数据库的要求。

• 以相似的成本获得更优质的数据

只需一次扩增和测序，即可获得核心 CODIS 和欧洲标准位点集（European Standard Set，ESS）STR 位点的易辨别数据，并且成本与传统 CE 分析相当。无论您的通量要求如何，都能释放下一代测序的威力，并有两种规格的测序试剂盒可供选择。

• 提供全面的集成和支持

ForenSeq MainstAY Kit 的端到端工作流程以成熟的 ForenSeq 流程为基础，可在单一、成熟可靠的平台上进行多种 DNA 分析。ForenSeq MainstAY Kit 与 UAS 无缝关联，可快速评估数据并一键生成报告。

Universal Analysis Software (UAS) 中的 MainstAY 分析模块可使用熟悉的质量分数、阈值和指引对测序数据进行评估。解决方案中提供了预配置分析设置，实验室可根据需要进行修改。此外，该模块专为提升高容量法医实验室的运行效率而设计，其精简的项目和样本概览可轻松审查带有 QC 指示器的标记基因。新的分类和过滤功能使用户可以使用各种 QC 指示器对 STR 子集进行分类和评估。通过在等位基因鉴定和序列水平信息之间轻松导航的功能，可以更方便地对来自混合等位基因（如等位杂合子）人群的 STR 等位基因进行序列分析。

我们为从文库制备到测序再到分析的整个工作流程提供卓越支持。我们经验丰富的团队为您的设备和软件提供全面的服务覆盖、验证计划和实施指导，使您能快速轻松地将工作流程投入运行。