QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit

QIAGEN One-Step Ahead RT-PCR Kit中含有Sensiscript和Omniscript两种不同的逆转录酶，以及平衡配比的Taq DNA聚合酶和具有校对功能的高保真酶。热启动酶使得反应体系构建得以在室温条件下进行，便利的单管操作和优化的反应体系确保实验获得高灵敏度结果。带有颜色的指示剂染料使得实验人员能够分别对于电泳过程进行监控，并减少加样过程的失误。

QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit可对任意RNA模板进行便利、高灵敏度、特异性的RT-PCR。该试剂盒含有经优化的组分，使得逆转录和PCR扩增可在同一混合液中“一步”完成。独特的酶配比和专门的反应缓冲液确保了高效、特异性的逆转录反应和PCR反应在同一反应管中有序进行，无需额外的优化步骤（参见图示 Superior sensitivity以及 Superior specificity）。

​在逆转录步骤，Omniscript和Sensiscript逆转录酶上结合有逆转录阻断基团，使其处于非激活状态，不会在室温条件下生成非特异的转录产物。当温度升高至50°C时，阻断基团从逆转录酶上解离，逆转录酶迅速达到完全激活状态。

​PCR扩增步骤受三种经平衡配比的DNA聚合酶催化。在室温下，QuantiNova DNA Polymerase处于抗体介导的阻断酶活状态。它在95ºC孵育5分钟后即可恢复活性，在第一个热循环即可实现高度特异性的扩增。HotStarTaq DNA Polymerase的酶活性逐渐提高，确保PCR的高产量。具有校对功能的高保真DNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，同样是95ºC孵育5分钟活化，确保扩增的高度准确性和持续合成能力。预混液中含有新型双阳离子PCR buffer，确保在宽泛的退火温度范围内，都可生成高特异性PCR产物。RT-PCR反应还采用了Q-Solution，这一组分有助于对于富含GC或含有复杂二级结构的模板进行高效的逆转录和扩增（参见图示 Amplification of GC‐rich amplicons）。

​室温下进行反应体系构建这一特点，使该试剂盒可便利的用于自动化体系构建流程中。PCR预混液含有反应所需缓冲液、dNTP和DNA聚合酶,而含有逆转录酶和RNase抑制剂的RT-Mix则单独包装，确保逆转录反应不会提前进行。在进行反应体系构建时，仅需将引物、模板RNA和RT-Mix加入预混液中。

​该试剂盒中含有加样指示剂，能有效防止移液错误的发生，确保结果的可靠。显色体系由预混液指示剂和模板指示剂两部分组成，通过颜色变化即可轻松判断反应体系中是否加入模板，减少反应构建时的失误（参见图示 Optional pipetting control）。该试剂盒还经专门优化，可适用于双重PCR，能够在单一反应体系中同时扩增阳性内质控。试剂盒中含有的RNase抑制剂能够防止因RNase污染而导致的RNA降解。

QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit适用于对各种RNA模板进行灵敏、便利的一步法RT-PCR。酶混合液经过特别配比，适用用于逆转录和PCR扩增反应。Omniscript和Sensiscript逆转录酶对RNA模板具有高亲和性，即便对于低至1 pg的RNA也能进行高效、灵敏的逆转录。逆转录反应结束后，95°C孵育5分钟，激活DNA聚合酶，同时逆转录酶失活。这一热启动步骤能够避免产生引物二聚体等非特异性扩增产物，并且减少背景条带弥散的发生，确保高度灵敏性、可重复的RT-PCR反应。

​引物最佳退火温度取决于其碱基组成、引物浓度和离子反应环境。QIAGEN PCR Buffers含有K⁺和NH⁴⁺，确保在宽泛的退火温度范围内，均可生成特异性PCR产物（参见图示 NH⁴⁺ and K⁺ cations in QIAGEN PCR buffers increase specific primer annealing）。在此条件下非特异性结合的引物二聚体无法稳定存在，因此可确保反应的特异性。由于反应对于温度条件的要求降低，减少了繁琐的温度优化过程。与此相反，在使用仅含有K+的的PCR或一步法RT-PCR缓冲液时，理想的PCR退火温度范围较小，并且难以预测。QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Buffer经特别设计，能够用于高效的逆转录和PCR扩增反应。缓冲液中含有的新型添加物组分能够防止逆转录酶对于PCR扩增反应的抑制，解决了这一在一步法RT-PCR经常面临的问题。这一特制的缓冲液确保引物能够在宽泛的温度和Mg²⁺浓度范围内实现与模板的特异性结合，进而确保对各种RNA模板进行灵敏、高效的RT-PCR反应。

QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit中含有特殊的Q-Solution组分，它能够对于核酸的熔解行为进行修饰，促进富含GC或二级结构的困难模板的逆转录和扩增。QIAGEN OneStep RT-PCR Kit含有进行RT-PCR的全部所需试剂，适用于即便是最敏感的应用（参见下表）。



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QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit能够进行便利、快速的RT-PCR反应，适用于多种应用，包括病毒检测、分子诊断研究、以及基因表达分析。只需将逆转录酶混合液、引物和模板加入到预混液中，即可开始热循环。反应体系构建可以在室温条件下进行，可选择性加入预混液和模板变色指示剂，以避免在移液过程中可能发生的错误。反应混合液中含有逆转录和PCR扩增反应所需的全部试剂。

QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit适用于以下RT-PCR应用：

• 病毒检测   
• 基因表达分析