dPCR 入门

dPCR 的发展

当今复杂的研究问题需要的信息深度超出了传统 PCR 技术的能力。第三代数字 PCR 缩小了这一差距，成为解决这些日常研究问题的更简单、更实用的技术。

数字 PCR 技术的概念出现于 1992 年，当时 Sykes 等人将其称为“有限稀释 PCR”。该通用方法采用了终点分析及泊松分布统计公式来量化样本中核酸分子的绝对数量。随后，Vogelstein 和 Kinzler 于 1999 年做出了重大贡献，他们开发出了一种方法，即，将样本稀释并分配至称为分区的单个反应单元中，并在扩增后检测及分析带有荧光信号的单个产物。当时他们创造了“数字 PCR”这个沿用至今的术语。

多年来，人们对这些方法进行了创新和商业化，以扩大其应用范围。数字 PCR 可在微流控芯片及微流磁盘、微阵列及基于油水乳液的微液滴或液滴晶体上进行；最近以来，还可在类似 qPCR 的孔板中进行。

仍在寻找什么是数字 PCR 的答案？看一看我们的工作台指南，详细了解数字 PCR 的基本原理、优势、局限性和应用。

数字 PCR 可实现核酸的绝对定量，而无需参考或标准曲线。该方法将样本分成数千个单独的反应，对抑制剂的耐受性高，具有高精确度、灵敏度和重复性。由于这些特点，越来越多的研究人员将数字 PCR 应用于拷贝数变异分析、罕见突变检测、病毒载量检测、基因表达分析、下一代测序文库定量及其他应用。

分而治之

虽说样本制备步骤与 qPCR 相同，但是数字 PCR 中有一个独特的“微分化”步骤，在这个步骤中，样本在扩增前被微分化成成千上万个独立的反应单元。与 qPCR 中的整体分析不同，数字 PCR 通过将核酸分子随机分配到各反应分区中，可有效地减少竞争靶点的影响，提高了对罕见物的检测精度和灵敏度。

研究者可使用数字 PCR 来：

• 定量低丰度靶标或复杂背景中的靶标
• 检测和区分等位基因突变 (SNP)
• 监测 qPCR 无法检测到的靶标基因微小倍数变化

泊松分布法则为微分化带来意义

与 Real-time qPCR 不同，数字 PCR 不依赖于每个扩增循环后荧光信号的检测以确定靶标分子的相对定量；它依赖于泊松分布统计公式以确定终点扩增后靶标分子的绝对定量。

鉴于靶标分子被随机分配至所有有效的反应分区中，泊松分布可估计每个反应分区的平均分子数目（零个、一个或多个），并计算出每个反应分区中的靶标分子的拷贝数。对阳性和阴性反应分区数目进行泊松分布统计分析可获得靶标序列的准确绝对数量。