数字 PCR 用 miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay

• 为任何 miRNA 设计自己的 LNA 增强型数字 PCR 引物组
• 出色的灵敏度，允许仅从 1 pg 总 RNA 中定量 miRNA
• 高度特异性，能够将密切相关的 miRNA 和成熟 miRNA 与前体区分开
• 快速简单的两步法 dPCR 方案，耗时小于 3 小时
• 基于QIAcuity 仪器和 QIAcuity EG PCR Kit，推动dPCR技术实现miRNA 基因表达的绝对定量

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay 是定制设计的 miRNA PCR 引物组，可实现极其敏感和特异性的 miRNA 定量。正向和反向 PCR 扩增引物均具有 miRNA 特异性，并使用 LNA 技术进行了优化。这些检测方案以管装形式提供，并且足够在Nanoplate 8.5k中运行 166 次反应（每次反应 12 μl）或在Nanoplate 26k 中运行 50 次反应（每次反应 40 μl）的引物。使用 miRCURY LNA RT Kit 执行上游 cDNA 合成步骤，使用 QIAcuity EG PCR Kit 在 QIAcuity 仪器上进行数字 PCR 扩增。

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使用 QIAcuity EG PCR Kit 和 QIAcuity 仪器进行数字 PCR 优化

miRCURY LNA miRNA PCR Assay 专为高特异性靶标扩增而设计。定量可通过两种 PCR 方法进行：使用常规实时荧光定量热循环仪的 qPCR 和使用 QIAcuity 仪器及 QIAcuity EG PCR Kit 的数字 PCR。使用 miRCURY LNA RT Kit 获得cDNA 后，数字 PCR 可提供高度精确的靶标定量，可在最低浓度水平检测到甚至是最微小的表达改变。主要 miRNA 中的一部分检测方案在 QIAcuity 仪器上经过湿实验验证。

LNA 可增强 PCR 性能

miRCURY LNA miRNA PCR Assay 在开发中采用了最严格的设计标准和经实验室验证的算法。严格的检测选择过程确保每个引物对提供最高的特异性和效率，以获得最可靠和准确的结果。T_m 归一化和 LNA 增强使得引物具有比标准 DNA 引物更高的结合亲和力，从而大大提高了检测灵敏度和特异性。

与使用茎-环或标准 DNA 引物的其他 miRNA PCR 系统相比，LNA 增强的引物提供了显著提高的灵敏度，特别是对富含 AT 的 miRNA

设计流程

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay 设计工具可以方便地为任何未作为预先设计产品提供的miRNA设计高灵敏度和特异性的lna增强PCR引物对。高级算法基于 60 多项不同标准评估大约 3,000 个引物对设计，从而在数分钟内为您的 miRNA 找到最佳的 LNA 引物组。该工具专为 miRNA 设计，但也可用于其他长度为 14–27 个核苷酸的小 RNA。
设计标准包括：

• 通过改变引物的 LNA 分布来优化熔解温度，从而确保高扩增效率和特异性。
• 计算并调整自杂交和交叉杂交分数，从而实现高效 PCR 反应。
• 进行调整以避免 PCR 反应中潜在的引物二聚体形成。
• 基于我们对 LNA 寡核苷酸设计的丰富知识，能够智能定位引物中的 LNA 碱基。
• 进行 miRBase 搜索以识别具有高度序列相似性的潜在 miRNA。这确保引物对小RNA具有高度特异性。

独特的 miRNA 分析系统

miRCURY LNA miRNA PCR Assay通过结合使用通用 RT 和 LNA PCR 扩增，在 microRNA PCR 市场上提供了性能和易用性的最佳组合（参见图片  miRCURY-LNA miRNA 数字 PCR 系统示意图）。通用RT使得使用一个第一链cDNA合成反应作为多个miRNA real-time PCR分析的模板成为可能。这节省了宝贵的样本，减少了技术差异，并且节省了实验室内的工作时间。此外，正向和反向 PCR 扩增引物均具有 miRNA 特异性，并使用 LNA 进行了优化。这提供了 1) 极高的灵敏度和极低的背景，能够准确定量极低的 miRNA 水平，2) 高度特异性检测，能够区分密切相关的 miRNA 序列。

有关 QIAcuity Nanoplate 中 dPCR 反应的原理说明，请参见这里。

用于归一化的参比基因检测方案

有五套经过验证的参比基因引物组可用于 dPCR，可进行高质量的数据归一化，并可从许多不同的样本类型中生成可靠的数据(见下表)。这些对照引物组以在不同人体组织中组成性地和相对稳定地表达的内源性、非编码小 RNA 为靶标（参见图片 参比基因在不同人体组织中的表达水平）。对照参考基因提供了在一系列miRNA表达上进行精确和可靠定量归一化的可能性。有关更多信息，请参阅 miRCURY PCR 对照品页面。

可用的参比基因检测方案列表

* 经验证可用于数字 PCR。

简单快速的基于纳米微孔板的工作流程

微分化、热循环和成像均集成到单一全自动的仪器上，可在 2 小时内获取实验结果。纳米微孔板格式适合在反应体系制备中的前端自动化操作，因而可进一步减少手动操作时间。
就像 qPCR 实验一样，反应体系制备包括稀释后样本的转移，以及将预混液和引物添加到一个 96 孔或 24 孔纳米微孔板中。该系统将分散、循环和成像集成到单个全自动化的仪器上，使用户可在 2小时内获得结果。您可在 Software Suite 上进行远程分析，该软件可针对您的靶序列及内置的质量控制选项，给出以每微升的拷贝数表示的浓度。

miRCURY LNA miRNA PCR Assay 和 QIAcuity Digital PCR System 的结合使用可实现数字 PCR 用于成熟 miRNA 定量分析。