使用数字 PCR，您可做些什么？
无论您是处理珍贵样本、分析罕见突变还是研究充满抑制剂的样本，纳米微孔板 dPCR 都能提供精确、可重现的数据。快速、自动化的工作流程显著降低了可变性，提高了一致性，而且非常简单，只需很少量的培训即可掌握。
数字 PCR，特别是 QIAcuity 上的纳米微孔板 dPCR，正在通过从根本上改变您可以提出和回答的问题，给研究工作带来革命性的变化。该方法推动了以前因 qPCR 和其他 dPCR 技术的局限性而受阻的应用。通过下文了解该技术在您的特定应用中的作用。
罕见突变检测
罕见突变检测 (RMD) 是指检测某个仅以极低的频率（低于 1% 甚或 0.1%）存在于野生型背景池中的序列突变。因此，对于诸如点突变或单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 等罕见事件的检测和定量，需要采用一种灵敏、准确和精确的方法。相关挑战在于区分两种高度相似的序列，且其中一个序列的丰度显著高于另一个序列。
使用纳米微孔板 dPCR 进行罕见突变检测的优点
- 能够将大型输入反应体积加载到 26,000 个分区中，从而显著提高找到罕见靶标的几率
- 对突变体和野生型进行多重测序，以在丰富的野生型背景下检测低分数的罕见突变体分子
探索我们用于临床测试和肿瘤学研究的 QIAcuity 解决方案
拷贝数变异分析
拷贝数变异（CNV）分析可确定某个个体的基因组中每个特定基因的拷贝数。众所周知，每个基因组中的各基因有两个拷贝，然而，这些基因在某些情况下会以更高的频率出现。除了点突变、易位和倒位等基因组改变之外，基因扩增（可激活癌基因）和缺失（可使肿瘤抑制基因失活）是涉及癌症相关基因的重要拷贝数改变 (Copy Number Alteration, CNA)。大多数受 CNA 影响的癌症相关基因都被定义为参与致癌作用和癌症进展的癌症信号通路中的关键基因。CNV 是遗传多样性（基因座的缺失或重复）的重要来源，可用于研究与常见神经和自身免疫疾病、遗传病和不良药物反应相关的基因。
使用纳米微孔板 dPCR 进行 CNV 分析的优点
- 检测小于 1.2 倍的 CNV 变化，约 2 小时得出结果
- 利用 8.5K Nanoplate 提高 dPCR CNV 分析的经济性和通量水平，或利用 26K Nanoplate 提高多重检测能力或更精细地区分连续拷贝数状态
- 使用 QIAcuity Software Suite 自动计算 CNV 以及设计自定义检测的能力
液体活检
液体活检又称为液态活检或液相活检，是指对非实体生物组织（主要是血液）的取样和分析。 它主要用作癌症等疾病的诊断和监测。与组织活检相比，液体活检对供体的创伤性更小。当肿瘤细胞死亡时，它们会将 ctDNA 释放到血液中。ctDNA 中的肿瘤突变可反映在传统肿瘤活检中发现的突变，因而可被用作分子标记物以追踪疾病情况。相关挑战在于血液中来自肿瘤细胞的 ctDNA 浓度非常低。黄金标准是使用 NGS、焦磷酸测序或 real-time PCR，但这些方法的缺点一直在于 LOD 的局限性。肿瘤组织焦磷酸测序的 LOD 大约为 10%，NGS 为 1–5%，而 qPCR 的检测限可低至 1%。由于检测水平的限制，这会造成供体残留疾病监测期间复发的问题。
使用纳米微孔板 dPCR 进行液体活检分析的优点
- 使用 QIAcuity Nanoplate 26K 最多可加载 28 µl 样本，以提高 LOD 并尽量减少二次取样误差 – 使您能够生成更多的数据点，以发现微小的表达变化或用于残留疾病监测
- 检测低至 0.01% 突变型等位基因频率的超罕见突变
- 处理全血和尿液等更原始的样本，因为 dPCR 测量不受扩增效率的影响
微生物检测
传染病和流行病爆发的日益盛行凸显了改进微生物（尤其是病原体）检测和分析的必要性。快速、高灵敏度、准确和绝对定量的结合对于公共卫生和流行病学中的病原体检测和微生物组分析至关重要。 数字 PCR 是一种快速、灵敏且精确的方法，非常有利于识别、检测、表征和监测病原体和微生物组的变化。dPCR 在微生物检测中的应用范围包括食品中的病原体、耐药性、微生物研究、抗菌耐药基因调查和病毒/细菌-宿主关系分析。
纳米微孔板 dPCR 用于微生物检测的优点
- 即使是复杂样本或含有大量抑制剂的样本，也能对微生物物质进行精确的绝对定量
- Nanoplate 26K 具有更大的样本容量（高达 28 µl），可提高灵敏度并检测低于其他商用检测的检测限的靶标
- 可从定制设计的检测或 700 多种微生物靶标（细菌、病毒、毒力因子、AMG 等）目录检测中进行选择，最多可同时进行五种检测
病毒载量定量
病毒载量测定测量生物样本中特定病毒的数量。结果报告为每毫升样本中病毒 RNA 的拷贝数。病毒载量测定用于诊断急性病毒性感染，指导治疗选择以及监测对药物治疗的反应。
使用纳米微孔板 dPCR 进行毒力基因检测的优点
- 使用 Nanoplate 26K 检测低丰度基因，可对每个样本进行更高程度的微分化，并采用更大的样本加载量
- 能够同时分析微生物和病毒靶标，只对感兴趣的序列进行高度特异性的检测
- 通过在一次反应中对多达五个靶标进行多重检测，实现精确高效的分析
细胞和基因治疗
数字 PCR 技术实现了一系列的基因治疗应用，包括腺相关病毒载体基因组滴度、慢病毒载体拷贝数定量以及 CAR-T 细胞治疗开发和生产。这对于在确保患者安全的同时开发有效且可重复的细胞和基因治疗至关重要。
病毒滴度测定
了解 QIAcuity dPCR 如何以更高的速度、通量和可扩展性，在病毒滴度定量中产生与传统 ddPCR 方法相同的准确度和精确度。了解从病毒载体裂解到残留 DNA 定量再到载体基因组滴度和基因组完整性测定这一兼具卓越准确度、重复性和速度的完整工作流程。
使用纳米微孔板 dPCR 进行 AAV 滴定的优点
- 得益于我们专用试剂盒的高效衣壳裂解和残留 DNA 去除，可稳定可靠地测定最终滴度
- 错误减少，使用一个方案即可轻松实施，只需最少量的手动步骤和 10 分钟的操作时间
- 使用具有不同染料组合的多达 10 种单一靶标检测进行多重检测，因此具有更高的准确度和灵活性；可选择扩展到 5 重感兴趣基因 (genes of interest, GOI) 检测能力
- 利用我们先进的 QIAcuity 软件功能，实现同时使用多达 5 个靶标对基因组完整性进行精确评估
残留宿主细胞 DNA 定量
残留宿主细胞 DNA (Host Cell DNA, HCD) 是生物制药产品生产过程中携带的 DNA。可接受的水平由监管机构（比如美国食品和药品监督管理局和世界卫生组织）确定。数字 PCR 残留 DNA 定量试剂盒是高度精确定量复杂生物工艺中 HCD 的理想选择。基因治疗、治疗蛋白和其他生物治疗开发过程中常用的宿主细胞包括人胚肾 293 (Human Embryonic Kidney 293, HEK293)、中国仓鼠卵巢 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 和 E. coli。
使用纳米微孔板 dPCR 进行残留宿主细胞 DNA 定量的优点
- 得益于预混合预混液和阳性/内部对照品，易于设置和检测宿主细胞 DNA
- 即使存在 PCR 污染物和抑制剂，也能精确检测 E. coli、CHO 和 HEK293 残留 DNA，检测精度可低至毫微微克级别
- 多拷贝物种特异性靶标检测确保结果不受 resDNA 片段化水平的影响
- 可使用经 dPCR 验证的标准品进行定量准确度验证或桥接研究
支原体检测
支原体是源自生物制药行业细胞系的生物制品污染物。支原体可能由于源细胞系本身（细胞基质）受到污染或在生产过程中偶然引入支原体而出现在细胞培养物中。可以找到有关生物制品生产过程中支原体安全性的多种污染风险指南和技术文献。
数字 PCR 可用于检测细胞培养物和其他源自细胞培养物的生物制品中的污染。例如，QIAcuity Mycoplasma Quant Kit 是一种 RT-dPCR 试剂盒，可检测 rRNA 和 DNA，使该方法具有高灵敏度。扩增内标可防止由于 PCR 抑制剂、RNA 提取不当或 RT 反应不当造成的假阴性。探针式检测可定量和检测 127 种不同的支原体。
使用纳米微孔板 dPCR 进行支原体检测的优点
- 合规：核酸技术 (Nucleic Acid Technique, NAT) 支原体检测工作流程符合欧洲、美国和日本药典的要求
- 快速：无需进行耗时的支原体培养
- 灵敏：由于单个细菌细胞中存在多个拷贝（检测率 < 10 CFU/mL），因此检测 rRNA 比仅检测 DNA 具有更高的灵敏度。如果跳过 RT 步骤，该检测仍能检测 DNA，因此具有高度灵活性。
- 已预先验证：该工作流程已作为全面验证报告的一部分进行了大范围测试，可减少您自己的验证工作量
- 十个用于内部验证或作为阳性对照品而不会引入活性支原体的 Mycoplasma Standard CFU Kit
miRNA 表达分析
MicroRNA (miRNA) 表达谱分析可同时比较多个或单个 miRNA 在两个或更多样本之间的表达水平。该分析可协助科学家识别和定量在疾病（比如癌症）中作为生物标志物的 miRNA。它可就在正常生物状态及疾病状态下 miRNA 表达的作用提供宝贵的见解。
纳米微孔板 dPCR 用于 miRNA 表达分析的优点
- 利用 dPCR 的高特异性鉴别序列密切相关型 miRNA 的单核苷酸差异
- 对细微的 miRNA 表达变化进行绝对定量，特别是在模板量较低的情况下
食品检测
多重数字 PCR 检测在食品行业有着广泛的应用，包括监管控制、质量保证、GMO 检测、食品欺诈检测和食源性疾病监测。这些检测可以鉴定动物物种和追溯肉制品的来源，如在一次反应中区分出猪、骆驼、绵羊、驴、山羊、牛和鸡。在 GMO 检测中，它们还用于定量转基因，研究表明，与 qPCR 相比，它们具有更高的灵敏度和可重复性。在检测食品欺诈方面，dPCR 检测可通过靶向特定线粒体和叶绿体 DNA 标志物，识别素食或纯素产品中的动物源性成分。此外，dPCR 还能有效地同时检测多种微生物病原体，如 E. coli、L. monocytogenes、S. aureus 和 S. enterica，从而确保食品安全和质量。
使用纳米微孔板 dPCR 进行食品检测的优点
- 得益于多重检测和 dPCR 能够尽量减少参比物质和样本之间的基质差异而对扩增效率的影响，是复杂基质样本的理想选择
- 得益于多达五个通道的多重检测和 8 微孔板系统，可实现高通量
- 因微分化作用降低背景信号，可对罕见 GMO 事件进行可靠的检测
单细胞分析
与批量分析细胞群的传统方法相比，单细胞分析可以获得单细胞水平的数据，帮助研究人员更充分地了解细胞异质性、生物学功能、过程和致病机理。常用的单细胞分析方法（包括 PCR、qPCR 或下一代测序 [next-generation sequencing, NGS]）有时缺乏检测相关靶标所需的灵敏度。
数字 PCR 是单细胞分析的新兴选择，因为它具有成本效益、直观且准确的 dPCR 平台，可提供高通量、高检测灵敏度和精确度。
使用纳米微孔板 dPCR 进行单细胞分析的优点
- 高精度的物理微分化比微滴更稳定
- 探针式检测允许在单个 dPCR 反应中对多达五个靶标进行多重检测，并且只需进行最小优化
- 精确的结果可实现在单细胞水平分析低丰度靶标和多拷贝靶标
基因组编辑检测 (CRISPR-Cas9)
诸如锌指核酸酶 (Zinc-Finger Nuclease, ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN) 和成簇规律间隔短回文重复序列 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR) 用于任何细胞的基因组编辑。这些核酸酶可产生位点特异性 DNA 双链断裂 (DSB)，而这些断裂可通过不精确、易出错的非同源末端连接 (NHEJ)（供体模板/精确点突变）或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复，从而导致靶向突变。因而，可生成一个由具有非均质 Indel 错误和不同等位基因编辑频率的细胞组成的混合群体。随后，将测定所需基因座上的基因组编辑频率。克隆细胞系以分离出单个细胞，随后检测这些细胞以确认基因组编辑事件。
使用纳米微孔板 dPCR 进行基因组编辑检测 (CRISPR-Cas9) 的优点
- 具有更高的灵敏度，可检出频率为 0.5% 的编辑事件
- 可采用低至 5 ng 的总 gDNA 材料对编辑事件进行绝对定量
- 可区分克隆种群中的纯合和杂合编辑
NGS 文库定量
下一代测序文库定量是以最高效率利用流动池的必要步骤。有证据表明，文库定量不准确后导致的 NGS 文库的超载或欠载都会对数据输出和质量产生不利影响。使用数字 PCR 确定 NGS 文库池的绝对浓度对获得最佳产量和降低单位样本的成本大有裨益。
使用纳米微孔板数字 PCR 进行 NGS 文库定量的优点
- 可对可扩增文库片段进行绝对定量，无扩增偏差，无标准偏差，2 小时内得出结果，适用于常规测试
- 文库池化具有高重复性和卓越的均匀性，一次检测即可覆盖所有 Illumina 文库类型
蛋白质定量和相互作用
Actome 蛋白质相互作用偶联 (Protein Interaction Coupling, PICO) 技术得益于 QIAcuity Digital PCR System，可以为检测和定量单个蛋白质和蛋白质相互作用提供一种高度通用和灵敏的方法。PICO 技术可将复杂的蛋白质状态转化为 DNA 条形码，以便使用 dPCR 进行扩增和检测。此方法非常有用，特别是在研究细胞通路、寻找蛋白质生物标记物、开发药物研究新检测方法或进行多组学分析时。
使用纳米微孔板 dPCR 进行蛋白质检测的优点
- 市场上唯一使用 dPCR 定量蛋白质的技术
- 在单细胞水平检测蛋白质、蛋白质间相互作用和转译后修饰
