黏端或平端：修饰、退火和连接
克隆和 DNA 重组技术为研究基因和细胞在健康及疾病中的作用提供了许多见解。现在，随着创新性应用的出现，例如组合文库的高通量集合和表观遗传学修饰的定位，克隆技术及其应用已经有了进一步发展。
克隆相关酶产品
将模板 DNA 克隆到合适的质粒载体之前，可能需要进行末端修饰。确定用于克隆的 DNA 通常通过限制性酶切或 PCR 扩增从其来源中提取。 Klenow 片段、T4 DNA 聚合酶和 T4 多核苷酸激酶等专用酶产品可以修饰 3’ 或 5’ 末端，从而改善 DNA 片段和载体之间的共价连接。
接下来的克隆步骤是使用适合于使载体和插入片段末端退火的酶产品进行连接。
加尾通常是为了制备 T 载体用于 TA 克隆，或在高保真聚合酶（非 Taq）产生的 PCR 产物上加 A 尾用于 TA 克隆。使用 Taq DNA 聚合酶扩增的产物已经带有 A 尾。
DNA 的末端修饰
* T4 DNA 聚合酶的 3’→5’ 核酸外切酶活性对于不依赖序列和连接的克隆 (SLIC) 方案至关重要。
† 向平端 DNA 的转化是通过利用 T4 DNA 聚合酶 (P7080) 的 5’→3’ 聚合酶和 3’→5’ 核酸外切酶活性实现的。T4 多核苷酸激酶 (Y9040) 确保平端 DNA 片段的末端被 5’-磷酸化，以便随后通过 T4 DNA 连接酶进行连接。
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DNA 连接
* 热稳定；用于需要双链 DNA 结构的高温和高严格连接的应用。
† 耐热性；用于没有缺口或错配碱基对的精确切口连接。
† 耐热性；用于没有缺口或错配碱基对的精确切口连接。
这是一种 SLIC 克隆方式
不依赖序列和连接的克隆 (SLIC) 利用了核酸外切酶活性：
用于下一代测序的克隆
用于下一代测序的文库制备从片段化 DNA 开始。通过酶的作用完成克隆步骤。
构建 DNA 文库所需的所有酶组分都可以用接头组装成“自制”文库制备试剂盒。
基因合成
基因合成是基于连接具有长互补重叠区域的寡核苷酸。
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