디지털 PCR로 무엇을 할 수 있나요?
귀중한 샘플을 다루거나, 희귀 돌연변이를 분석하거나, 억제제가 가득한 샘플을 분석할 때 나노플레이트 dPCR은 정확하고 재현 가능한 데이터를 제공합니다. 빠르고 자동화된 워크플로는 변동성을 크게 줄이고 일관성을 개선하는 동시에 매우 간단하여 숙달하는 데 거의 교육이 필요하지 않습니다.
디지털 PCR, 특히 QIAcuity의 나노플레이트 dPCR은 묻고 답할 수 있는 질문을 근본적으로 변화시켜 연구에 혁신을 불러일으키고 있습니다. 이 기술은 이전에는 qPCR 및 기타 dPCR 기술의 한계로 인해 가로막혔던 응용 분야에 활력을 불어넣고 있습니다. 아래에서 이 기술이 특정 응용 분야에 어떤 도움을 줄 수 있는지 알아보세요.
희귀 돌연변이 검출
희귀 돌연변이 검출(Rare Mutation Detection, RMD)은 야생형 백그라운드 풀에서 매우 낮은 빈도(1% 미만 또는 심지어 0.1% 미만)로만 존재하는 염기서열 변이체를 검출하는 것을 의미합니다. 따라서 점 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)과 같은 희귀 이벤트를 검출하고 정량화하기 위해서는 민감하고 정확하며 정밀한 방법이 필요합니다. 문제는 하나가 다른 것보다 훨씬 존재비가 높을 경우 두 개의 매우 유사한 염기서열을 구별하는 것입니다.
희귀 돌연변이 검출을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 26,000개의 파티션에 대량의 투입 반응량을 로드할 수 있어 희귀 표적 검출 확률 크게 향상
- 존재비가 높은 야생형 백그라운드에서 희귀 돌연변이 분자의 낮은 분획을 검출하는 돌연변이 및 야생형 염기서열 분석에 대한 멀티플렉싱
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복제수 변이 분석
복제수 변이(Copy number variation, CNV) 분석은 개인의 유전체에 있는 특정 유전자의 복제 수를 결정합니다. 유전자는 유전체당 두 개의 복제본이 발생하는 것으로 알려졌지만, 이러한 유전자는 경우에 따라 더 자주 발생할 수 있습니다. 유전자 증폭(종양 유전자를 활성화함) 및 결실(종양억제 유전자를 비활성화함)은 점 돌연변이, 전위 및 역전과 같은 유전체 변화 외에도 암 관련 유전자에 영향을 미치는 중요한 복제수 변경(Copy Number Alteration, CNA)입니다. CNA의 영향을 받는 대부분의 암 관련 유전자는 발암과 암 진행에 관여하는 암 신호 경로에서 중요한 유전자로 정의되어 있습니다. CNV는 유전적 다양성(유전자좌의 결실 또는 중복)의 필수 원천이며 흔히 발생하는 신경계 및 자가면역 질환, 유전적 병태 및 약물 부작용과 관련된 유전자를 연구할 수 있습니다.
CNV 분석을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- CNV 내 1.2배 미만의 변화 검출, 약 2시간 만에 결과 제공
- 8.5K 나노플레이트 또는 멀티플렉싱 기능으로 경제성 및 처리량 수준 향상 또는 26K 나노플레이트로 연속 복제수 상태의 정밀한 판별을 통해 dPCR CNV 분석의 경제성 및 처리량 향상
- QIAcuity Software Suite를 통한 CNV 자동 계산 및 맞춤형 분석 설계 가능성
액체 생검
유체 생검 또는 유체 상 생검이라고도 하는 액체 생검은 주로 혈액과 같은 비 고체 생물학적 조직을 채취하고 분석하는 것입니다. 액체 생검은 암과 같은 질병에 대한 진단 및 모니터링 도구로 주로 사용됩니다. 액체 생검은 조직 생검에 비해 공여자에게 덜 침습적입니다. 종양 세포가 사멸하면 ctDNA를 혈액으로 방출합니다. ctDNA의 암 돌연변이는 기존의 종양 생검에서 발견되는 변이를 반영하므로 질병을 추적하는 분자 바이오마커로 사용할 수 있습니다. 문제는 혈액 내 종양 세포의 ctDNA 농도가 낮다는 것입니다. 기존의 표준 방식은 NGS, 파이로시퀀싱 또는 real-time qPCR을 사용하는 것이었지만, 이러한 방식의 단점은 LOD에 한계가 있다는 점입니다. 종양 조직의 파이로시퀀싱은 약 10%, NGS는 1~5%, qPCR은 1%까지 검출할 수 있습니다. 이는 검출 수준의 한계로 인해 공여자의 잔류 질병 모니터링 중 재발에 대한 문제를 야기합니다.
액체 생검 분석을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 최대 28µL의 샘플을 로드하여 LOD를 높이고 서브 샘플링 오류를 최소화하는 QIAcuity Nanoplate 26K - 발현의 작은 변화를 검출하거나 잔류 질병 모니터링을 위해 더 많은 데이터 포인트 생성 가능
- 0.01%의 변이 대립 유전자 빈도까지의 극히 드문 돌연변이 검출
- dPCR 측정은 증폭 효율에 영향을 받지 않으므로 전혈 및 소변과 같은 더 많은 미정제(crude) 샘플 취급 가능
미생물 검출
전염병과 유행성 질병의 유병률이 증가함에 따라 미생물, 특히 병원체의 검출과 분석 개선 필요성이 강조되고 있습니다. 속도, 높은 민감도, 정확도 및 절대 정량화의 조합은 공중 보건 및 역학에서 병원체 검출 및 마이크로바이옴 분석 모두에 필수적입니다. 빠르고 민감하며 정밀한 방법인 디지털 PCR은 병원체와 마이크로바이옴의 변화를 식별, 검출, 특성화, 모니터링하는 데 매우 유용합니다. 식품 내 병원체, 약물 내성, 미생물 연구, 항균제 내성 유전자 조사, 바이러스/박테리아-숙주 관계 분석 등 미생물 검출에서 dPCR의 응용 분야는 매우 다양합니다.
미생물 검출을 위한 나노플레이트 dPCR의 이점
- 복잡한 샘플이나 억제제가 많이 함유된 샘플에서도 미생물 물질을 정확하고 절대적으로 정량화
- 나노플레이트 26K로 더 많은 양의 샘플(최대 28µL)을 처리하여 민감도를 높이고 다른 상용 분석의 검출 한계보다 적은 양의 표적 검출 가능
- 미생물 표적(박테리아, 바이러스, 독성 인자, AMG 등)에 대한 맞춤형 분석 또는 700개 이상의 카탈로그 분석 중에서 선택하여 최대 5개의 분석을 멀티플렉싱
바이러스 부하 정량화
바이러스 부하 검사는 생물학적 샘플 내 특정 바이러스의 양을 측정합니다. 결과는 샘플 1밀리리터당 바이러스 RNA 복제수로 보고됩니다. 바이러스 부하 검사는 급성 바이러스 감염을 진단하고, 치료 방법을 선택하도록 지원하며, 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용됩니다.
독성 유전자 검출을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 샘플당 파티셔닝 수가 많고 샘플 로드 용량이 더 큰 나노플레이트 26K로 존재비가 낮은 유전자 검출
- 미생물 및 바이러스 표적 모두 분석 가능, 관심 있는 염기서열만을 매우 특이적으로 검출
- 한 번의 반응으로 최대 5개의 표적을 멀티플렉싱하여 정확하고 효율적인 분석 가능
세포 및 유전자 치료
디지털 PCR은 아데노 연관 바이러스 벡터 유전체 역가, 렌티바이러스 벡터 복제수 측정, CAR-T 세포 치료제 개발 및 제조를 포함한 다양한 유전자 치료에 응용할 수 있습니다. 이는 환자의 안전을 보장하면서 효과적이고 재현 가능한 세포 및 유전자 치료를 개발할 때 매우 중요합니다.
바이러스 역가 측정
QIAcuity dPCR이 바이러스 역가 정량화에서 어떻게 기존의 ddPCR 방법과 동일한 수준의 정확성과 정밀도를 제공하면서도 속도와 전체적인 처리량 및 확장성을 향상하는지 알아보세요. 뛰어난 정확도, 재현성, 속도로 바이러스 벡터 용해부터 잔류 DNA 정량화, 벡터 유전체 역가 측정 및 유전체 무결성 측정에 이르는 전체 워크플로를 살펴보세요.
AAV 역가 측정을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 전문 키트를 통한 효율적인 캡시드 용해 및 잔류 DNA 제거로 일관되고 안정적인 최종 역가 측정
- 최소한의 수동 단계와 단 10분의 수작업 시간이 필요한 하나의 프로토콜로 오류 감소 및 손쉬운 구현
- 다양한 염료 조합으로 최대 10개의 단일 표적 분석을 멀티플렉싱하여 정확도와 유연성 향상, 관심 유전자(Genes Of Interest, GOI) 분석으로 5-plex 용량까지 확장 가능
- 고급 QIAcuity 소프트웨어 기능으로 최대 5개의 표적을 동시에 사용하여 유전체 무결성을 정밀하게 평가
잔류 숙주 세포 DNA 정량화
잔류 숙주 세포 DNA(Host Cell DNA, HCD)는 바이오 의약품의 제조 과정에서 혼입됩니다. 허용 수준은 미국식품의약국(FDA) 및 세계보건기구(WHO)와 같은 규제 기관에서 설정합니다. 디지털 잔류 DNA 정량화 키트는 복잡한 바이오 프로세스에서 HCD를 매우 정밀하게 정량화하는 데 이상적입니다. 유전자 치료제, 치료용 단백질 및 기타 바이오 치료제 개발에 사용되는 일반적인 숙주 세포로는 Human Embryonic Kidney 293(HEK293), Chinse Hamster Ovary(CHO), E. coli가 있습니다.
잔류 숙주 세포 DNA 정량화를 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 사전 혼합된 마스터 믹스 및 양성/내부 대조물질 덕분에 셋업과 숙주 세포 DNA 검출이 용이
- PCR 오염 물질 및 억제제가 있는 경우에도 E. coli, CHO 및 HEK293 잔류 DNA를 펨토그램 단위까지 정확하게 검출
- 다중 복제 종 특이적 표적 분석으로 결과가 resDNA의 단편화 수준에 영향을 받지 않도록 보장
- dPCR 검증 표준을 사용하여 정량 정확도 검증 또는 연계 연구 가능
미코플라스마 검출
바이오 제약 산업에서 미코플라스마는 세포주에서 유래한 생물학적 제품의 오염 물질입니다. 미코플라스마는 원천 세포주 자체(세포 기질)의 오염 또는 생산 중 미코플라스마의 우발적 유입으로 인해 세포 배양물 내에 나타날 수 있습니다. 생물학적 제품 제조 시 미코플라스마 안전에 관한 여러 오염 위험 가이드라인과 기술 문서를 이용할 수 있습니다.
디지털 PCR은 세포 배양 및 기타 세포 배양 유래 생물학적 물질의 오염을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, QIAcuity Mycoplasma Quant Kit는 rRNA와 DNA를 검출하는 RT-dPCR 키트로, 높은 민감도의 분석이 가능한 키트입니다. 내부 증폭 대조물질은 PCR 억제제, 부적절한 RNA 추출 또는 부적절한 RT 반응으로 인한 위음성을 방지합니다. 프로브 기반 분석을 통해 127종의 다양한 미코플라스마를 정량화하고 검출할 수 있습니다.
미코플라스마 검출을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 규정을 준수함: 유럽, 미국, 일본 약전을 준수하는 미코플라스마 검사를 위한 NAT(Nucleic Acid Technique, 핵산 기법) 워크플로
- 신속함: 시간이 오래 걸리는 미코플라스마 배양 불필요
- 민감함: rRNA를 검출하면 단일 박테리아 세포 내에 여러 개의 카피가 존재하기 때문에 DNA만 사용하는 것보다 더 민감도가 더 높습니다(<10CFU/mL 검출). RT 단계를 건너뛰더라도 분석이 DNA를 검출할 수 있어 유연성이 뛰어납니다.
- 사전 검증됨: 이 워크플로는 종합적인 검증 보고서의 일부로 광범위하게 시험 되어 자체 검증 노력을 줄일 수 있습니다.
- 핵심 미코플라스마 유입 없이 인하우스(in-house) 검증용 또는 양성 대조물질로 사용하기 위한 10개의 Mycoplasma Standard CFU Kit
유전자 발현 분석
유전자 발현 프로파일링은 두 개 이상의 샘플 간에 다중 유전자의 발현 수준을 동시에 비교합니다. 이 분석은 과학자들이 표현형 차이의 분자적 기초를 확립하고 심층 연구를 위한 유전자 표적을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유전자 발현 프로파일링은 정상적인 생물학적 상태와 질병에서 차등적 유전자 발현의 역할에 대한 귀중한 인사이트를 제공합니다.
유전자 발현 정량화를 위한 나노플레이트 dPCR의 이점
- 특히 적은 양의 템플릿에서 작은 배수의 변화 검출
- 투입량에 따라 1% 미만의 절대 농도와 존재비로 결과 검증
- 나노플레이트 26K로 높은 정밀도와 로그 5의 높은 동적 범위를 달성하거나, 나노플레이트 8.5K에서 ‘유사한’ 발현 표적(최대 약 4배 발현 변화)에 대해 12µL 반응 및 대량 처리 옵션으로 경제적인 실행 수행
miRNA 발현 분석
MicroRNA(miRNA) 발현 프로파일링은 두 개 이상의 샘플 간에 다중 또는 단일 miRNA의 발현 수준을 동시에 비교합니다. 이 분석은 과학자들이 암과 같은 질병의 바이오마커로서 miRNA를 식별하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 정상적인 생물학적 상태와 질병에서 miRNA 발현의 역할에 대한 귀중한 인사이트를 제공합니다.
miRNA 발현 분석을 위한 나노플레이트 dPCR의 이점
- dPCR의 높은 특이성 덕분에 서열이 매우 유사한 miRNA들 사이의 단일 뉴클레오티드 차이를 구별
- 특히 적은 양의 템플릿에서 미세한 miRNA 발현 변화를 절대적으로 정량화
식품 검사
멀티플렉스 디지털 PCR 분석은 규제 관리, 품질 보증, GMO 검사, 식품 사기 적발, 식품 매개 질병 모니터링 등 식품 산업에서 폭넓게 활용되고 있습니다. 이러한 분석을 통해 한 번의 반응으로 돼지, 낙타, 양, 당나귀, 염소, 소, 닭고기를 구별하는 등 동물 종을 식별하고 육류 제품의 원산지를 추적할 수 있습니다. 또한 GMO 검사에서의 유전자 정량화에도 사용되며, 연구에 따르면 qPCR에 비해 민감도와 재현성이 더 뛰어난 것으로 나타났습니다. 식품 사기 적발의 경우, dPCR 분석을 통해 특정 미토콘드리아 및 엽록체 DNA 마커를 표적으로 하여 채식 또는 비건 제품에서 동물 유래 성분을 찾아낼 수 있습니다. 또한 dPCR을 통해 E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, S. enterica 등 여러 미생물 병원체의 동시 검출이 가능해 식품 안전과 품질을 보장하는 데 효과적입니다.
식품 검사를 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 멀티플렉싱 및 표준물질과 샘플 간의 매트릭스 차이로 인한 증폭 효율의 영향을 최소화하는 dPCR의 기능 덕분에 복잡한 매트릭스 샘플에 이상적
- 최대 다섯 개 채널과 8-plate 시스템의 멀티플렉싱으로 대량 처리 가능
- 파티셔닝에 의한 백그라운드 감소로 희귀 GMO 이벤트를 신뢰성 있게 검출
단일 세포 분석
세포 집단을 대량으로 분석하는 기존의 방법에 비해 단일 세포 분석은 단일 세포 수준에서 데이터를 얻을 수 있어 연구자들이 세포 이질성, 생물학적 기능, 과정 및 질병 기전을 더 잘 이해할 수 있도록 도와줍니다. 단일 세포 분석에 일반적으로 사용되는 PCR, qPCR 또는 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing, NGS) 등의 방법은 관심 표적을 검출하기에는 민감도가 부족한 경우가 있습니다.
디지털 PCR은 많은 처리량, 높은 검출 민감도 및 정밀도를 제공하는 비용 효율적이고 직관적이며 정확한 dPCR 플랫폼 덕분에 단일 세포 분석을 위한 새로운 옵션으로 떠오르고 있습니다.
단일 세포 분석을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 미세방울 방식보다 안정적인 물리적 파티셔닝으로 높은 정확도 제공
- 프로브 기반 검출을 통해 최소한의 최적화로 단일 dPCR 반응에서 최대 5개의 표적 멀티플렉싱
- 정확한 결과를 통해 단일 세포 수준에서 낮은 존재비의 표적 및 다중 복제 표적 분석 가능
유전체 편집 검출(CRISPR-Cas9)
모든 세포의 유전체를 편집하는 데 아연 집게(Zinc-Finger, ZFN), 전사 활성제 유사 이펙터(Transcription Activator-Like Effector, TALEN) 및 일정 간격으로 분포하는 짧은 회문구조 반복서열 집합(clustered regular interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 등의 핵산분해효소가 사용됩니다. 이들 핵산분해효소는 부위 특이적 DNA 이중 가닥 절단(Double-Strand Break, DSB)을 생성하고, 이는 그다음에 부정확하고 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 연결(Non-Homologous End Joining, NHEJ)(공여자 템플릿/고정밀 점 돌연변이) 또는 상동성 지시 복구(Homology-Directed Repair, HDR)(결실/삽입결실/삽입) 경로에 의해 복구되어 표적 돌연변이 유발로 이어질 수 있습니다. 그 결과, 이질적인 삽입결실 오류와 다양한 대립 유전자 편집 빈도를 가진 세포의 혼합 집단이 발생합니다. 그런 다음 원하는 유전자좌의 유전체 편집 빈도를 측정합니다. 클론 세포주는 단일 세포를 분리한 다음 이를 분석하여 유전체 편집 이벤트를 확인합니다.
유전체 편집 검출을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점(CRISPR-Cas9)
- 더 높은 민감도로 0.5%의 빈도로 존재하는 편집 이벤트 검출 가능
- 적게는 5ng의 총 gDNA에서 편집 이벤트를 절대 정량화
- 클론 집단에서 동형접합 편집과 이형접합 편집을 구별하는 기능
NGS 라이브러리 정량화
차세대 염기서열 분석 라이브러리 정량화는 플로우 셀을 최대 효율로 사용하기 위한 필수 단계입니다. 부정확한 라이브러리 정량화 후 NGS 라이브러리에 과부하 또는 부족 부하가 걸리면 데이터 출력과 품질에 악영향을 미친다는 증거가 있습니다. NGS 라이브러리 풀의 절대 농도를 결정하기 위해 디지털 PCR을 사용하면 최적의 수율을 얻고 샘플당 비용을 줄이는 데 큰 도움을 받을 수 있습니다.
NGS 라이브러리 정량화를 위한 나노플레이트 디지털 PCR 사용의 이점
- 증폭 편향 및 표준 편향 없이 증폭 가능한 라이브러리 단편에 대한 절대 정량화, 2시간 내 결과 제공, 일상적인 검사에 적합
- 한 번의 분석으로 모든 Illumina 라이브러리 유형을 커버하는 높은 재현성 및 우수한 균일성을 갖춘 라이브러리 풀링 지원
단백질 정량화 및 상호 작용
Actome’의 단백질 상호 작용 커플링(Protein Interaction Coupling, PICO) 기술은 단일 단백질과 단백질 상호 작용을 검출하고 정량화하기 위한 매우 다양하고 민감한 접근법을 제공하는 QIAcuity Digital PCR System의 이점을 활용합니다. PICO 기술은 dPCR을 사용하여 복잡한 단백질 상태를 증폭 및 검출할 수 있는 DNA 바코드로 변환합니다. 이는 세포 전달 경로를 조사하거나, 단백질 바이오마커를 찾거나, 제약 연구를 위한 새로운 분석을 개발하거나, 다중 오믹스 분석을 수행할 때 특히 유용합니다.
단백질 검출을 위한 나노플레이트 dPCR 사용의 이점
- 시판 중인 단백질 정량화 기술 중 유일하게 dPCR을 사용하는 기술
- 단일 세포 수준에서 단백질, 단백질-단백질 상호 작용, 번역 후 변형을 검출
