Digital PCR用QuantiNova LNA PCR Custom Assays

• 簡便な設計ツールおよび当社の設計済みアッセイと同じアルゴリズムを使用して作成した高機能アッセイ
• 新しい転写産物、特異的アイソフォーム、またはスプライスバリアントの検出など、ターゲットとニーズに合致したカスタムアッセイ
• 最大10の配列を提示可能で、全配列を区別または検出できるアッセイ設計
• 短いLNA強化プライマーによる高特異性とアッセイ配置の高い柔軟性
• QIAcuity装置とQIAcuity EG PCR Kitを使用するdPCRによる発現変化の絶対定量

QuantiNova LNA PCR Custom Assaysは、LNA強化EvaGreenデジタルPCRで使用することで、あらゆるRNAターゲットの正確かつ高感度な遺伝子発現解析を提供します。堅牢な設計のアルゴリズムは、Ensemblデータベース内のヒト、マウス、ラットをターゲットとするデータに対応し、アッセイ作成を簡素化します。カスタムアッセイは、設計済みアッセイがないターゲットや、スプライスバリアントの区別および新しいmRNAまたはIncRNAの検証を行う場合に最適です。デジタルPCRでは、QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用してアッセイを最適化し、わずか2時間のシンプルかつ高速の絶対定量ワークフローを作成しました。

qPCR分析にQuantiNova LNA PCR Custom Assaysの使用を計画していますか？qPCR専用製品と性能の詳細は、qPCRカタログページでご覧いただけます。

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QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用するデジタルPCR分析の最適化

QuantiNova LNA PCR Assaysは、高特異性ターゲットの増幅を行うために開発されました。これは、2つのPCRメソッドで定量できます。標準リアルタイムサーマルサイクラーを使用するqPCRとQIAcuity装置およびQIAcuity EG PCR Kitを使用するデジタルPCRです（デジタルPCRにQuantiNova LNA PCR Assaysを使用する図を参照）。QuantiTect Reverse Transcription Kitを使用してcDNAを合成後、デジタルPCRにより、非常に正確にターゲットを定量し、最低濃度での最小発現変化さえも検出します。重要なアッセイのサブセットは、QIAcuity装置で実験的に検証されています。

高感度かつ高特異性のLNA強化アッセイ

QuantiNova LNA PCR Custom Assaysは、 厳格な設計基準とラボでバリデーション済みのアルゴリズムを用いて作成されています。遺伝子発現解析において、最高クラスの特異性と効率を発揮し、信頼できる正確な結果を提供します。

LNA塩基の高い結合親和性により、転写産物へのプライマー配置の柔軟性が向上するため、インテリジェントな位置調整を行って、他の方法では分析が困難なターゲットのアッセイを設計できます。これにより、AUリッチなターゲット、存在量の少ない転写産物、二次構造が高く、非常に複雑なサンプルのターゲットであっても、優れたターゲット識別と堅牢で信頼性の高い定量が可能になります。

高い感度により、’1 RNA分子まで優れた増幅効率が保証され、少ない出発物質からlncRNAなどの少量のターゲットをより簡単に検出することが可能となります。LNAの巧妙な配置による特異性の向上により、高いSN比が得られ、ひとつのヌクレオチドしか異ならない配列の識別が可能になり、非特異的増幅とプライマーダイマー形成が排除されます。

高度なLNA設計アルゴリズムを使用して作成

20年にわたるLNA設計の経験により、高度なLNA設計アルゴリズムを開発および最適化することができました。このアルゴリズムには、非常に厳格な性能基準に対して徹底的にラボで検証された50を超える–さまざまなパラメーターが組み込まれており、ターゲット検出–の成功を約束する最適なアッセイです。特別なご要望にお応えするために、130万を超えるアッセイの設計に使用してきた自社開発のアルゴリズムをGeneGlobeの便利なカスタムアッセイ用の機能としてご利用できます。

EvaGreenベースのデジタルPCR

dPCRによる絶対定量には、QuantiNova LNA PCR Assaysを、EvaGreenベースの蛍光検出を使用するQIAcuity EG PCR Kitと一緒に使用します。EvaGreenは、二本鎖DNA（SYBR^® Greenと同様）に結合し、DNA結合時に蛍光を発するインターカレーター色素です。EvaGreenベースのdPCRを使用すると、製品の増幅と検出に必要なのはプライマーセットのみなので利便性がもたらされ、節約につながります。また、dPCRナノプレートの数千ものパーティションに分割されるdPCR反応でより高い分解能が得られるので、dPCR反応に必要なプライマー濃度はqPCRに必要なプライマー濃度の半分です。

カスタム設計プロセス

QuantiNova LNA PCR Custom Assayの設計ツールを使用すれば、設計済みアッセイがないあらゆるmRNAやlncRNAに対応した高感度かつ高特異性のLNA強化PCRアッセイを簡単に設計できます。QuantiNova PCR Assayの高度な設計アルゴリズムが、50以上の基準をもとに数多くのアッセイの組み合わせを評価して、数分間でターゲットに最適なアッセイを見つけます。本ツールは、EnsemblおよびRefSeqなどの生物種データベースにおける55以上のヌクレオチドとブラストで構成されるヒト、マウス、ラットのmRNAおよびlncRNAターゲットに対応した設計となっています。既知の遺伝子ターゲットに対しては、gDNA増幅のリスクを防ぐために、設計済みアッセイと同様にイントロンをはさむアッセイを設計する設定になっています。

独自の高度なアッセイ設計オプション

カスタムアッセイ設計ツールには、スプライスバリアント、SNP、またはアイソフォームを区別するための転写産物特異的なアッセイを作成できるオプションがあります。あるいは、すべての転写バリアントに共通のアッセイを設計することも可能です。1度に最大10種類のターゲット配列を提示して、10種類のアッセイを設計するか、関連性のある転写産物に対して1つの共通のアッセイを設計することができます。

カスタムアッセイと容易に組み合わせて使用できるReference Gene Assays

高品質のデータ正規化を可能にし、信頼できる結果を保証するために機能的に検証した幅広いヒト、マウス、ラットのReference Gene Assayが利用可能です。このようなアッセイは通常、多種多様な組織で構成的に発現する内因性コーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、および核小体低分子RNA分子を対象としています。

mRNA/lncRNA qPCR結果の正規化

正規化により、調査中の生物学的変化とは関係のない技術的および生物学的なサンプル間変動が除去されます。適切な正規化は、結果を正しく分析し、解釈するために重要です。通常、安定して発現する参照遺伝子を正規化に使用します。

実際のmRNA/lncRNA発現解析をセットアップする前に、 いくつかの内因性対照リファレンス遺伝子候補を検証することをおすすめします。このような候補は、調査中のサンプルの全範囲にわたって安定して発現すると考えられる遺伝子から選択する必要があります。リファレンス遺伝子の候補は、文献や既存のデータ（たとえば、NGSやqPCRパネルスクリーニング）に基づいて選択した安定して発現するmRNAまたはlncRNAにすることができます。QuantiNova LNA PCRシステムは、安定して発現する傾向があるため、参照遺伝子候補として適するRNAに検証済み参照遺伝子アッセイを提供します。

すべてのリファレンス遺伝子候補は、各試験で経験的に検証する必要があります。多数のmRNA/lncRNAをプロファイリングするときにPCRパネルを正規化する選択肢の1つは、グローバル平均–、つまり発現したすべてのmRNA/lncRNAの平均に対して正規化することです。これは、コールレートが高いサンプル（発現遺伝子）では適切なオプションですが、コールレートが低いサンプルでは注意して使用する必要があります。また、一般的な遺伝子発現レベルが変化したサンプルでは適切な選択肢ではありません。正規化に関する詳細なガイドをGeneGlobe Data Analysis Centerでご覧いただけます。

デジタルPCRデータの解析

QIAcuity Software SuiteをdPCRデータの解析に使用します。これは遺伝子発現テストを含みます。このテストでは、結果を倍率変化および制御倍率として公開可能な数値で提供します。

2ステップRT-dPCR

QuantiTect Reverse Transcription Kit（カタログ番号 205311、205313、205314）で逆転写を行うと、最良の結果が得られます。QuantiNova Reverse Transcription Kitの使用はおすすめしません。結果として得られたcDNAを、QIAcuity EG PCR Kitのマスターミックスと、選択したQuantiNova LNA PCRアッセイを組み合わせてdPCRによる定量解析を行います。

重要な注釈：アッセイ製品名の後に括弧で示した反応量は、qPCRの使用に関連します。Digital PCRは、半分のプライマー濃度で済みますが反応量は異なります。QIAcuity Nanoplate 26Kを使用の場合、表示と同数の反応を設定できます。Nanoplate 8.5Kを使用すると、3.3倍設定できます。dPCRの指示に対するQIAcuityの使用については、ハンドブックをご参照ください。

出荷と配送

QuantiNova LNA PCR Assaysは常温で出荷します。在庫のアッセイは1–5日以内に配送されます。早期アクセス期間中は、配送時間が長くなると思われます。

QuantiNova LNA PCRシステムを用いたデジタルPCRに必要なもの

逆転写：QuantiTect Reverse Transcription Kit（カタログ番号205311、205313、205314）

dPCRマスターミックス：QIAcuity EG PCR Kit

Assays：

QuantiNova LNA PCR Custom Assaysは、次のようなアプリケーションに非常に適しています。

• mRNAおよびlncRNAの発現解析、プロファイリング、定量
• RNA-seq遺伝子発現データのバリデーション
• 遺伝子発現プロファイリング
• シグナルとパスウェイの解析
• LNA GapmeRまたはsiRNAによる遺伝子発現ノックダウンの確認
• 疾患関連バイオマーカーのスクリーニング、同定、検証を含むバイオマーカーの開発
• 遺伝子発現に関連する表現型の変化のモニタリング

複数の QuantiNova LNA PCR Assaysを使用して、遺伝子に特化したパネルを調査することもできます。