REPLI-g WTA Single Cell Kit

• シングルセルからでも全トランスクリプトームをカバー
• MDAテクノロジーによる配列のバイアスのほとんどない均一なWTA
• RNA-Seqを含む新テクノロジーでの使用に最適
• トータルRNAあるいはmRNA—濃縮（poly A+）RNAの増幅
• がん、および幹細胞研究のための革新的なツール

REPLI-g WTA Single Cell Kitは、シングルセルのトランスクリプトームレベルでの転写制御への影響に関する信頼できる研究を可能にし、シングルセル（1～1000細胞）からの全転写物の均一な増幅を実現します。専用のバッファーおよび試薬は、REPLI-g法による混入核酸の増幅をブロックするため、混入核酸を除去する独自のプロセスで処理されます。革新的な溶解バッファーで細胞RNAを効果的に安定化することにより、増幅されたRNAはin vivoでの遺伝子発現プロファイルを正確に反映します。全ての酵素反応のステップは、効率的なRNAの処理によるcDNAの正確な増幅のために開発されており、この行程で合成されたcDNAは革新的なMultiple Displacement Amplification（MDA）テクノロジーを使用してほぼバイアスのない配列で増幅されます。

実験ごとのばらつきが低く、全トランスクリプトームをカバー

多数のリードがタンパク質をコードするRNAにマッピング可能

信頼できる低量の転写産物の検出

様々なアプリケーションおよび研究分野で使用

REPLI-g WTA Single Cell Kitのユニークな成分

• キットに含まれる全ての酵素および増幅用成分には、REPLI-g で増幅可能なDNAおよびRNAのコンタミを排除するユニークで制御された核酸排除プロセスが施されます。
• 革新的な溶解バッファーで細胞RNAを効果的に安定化することにより、増幅されたRNAはin vivoでの遺伝子発現プロファイルを正確に反映します。
• 全ての酵素反応のステップは、効率的なRNAの処理によるcDNAの正確な増幅のために開発されました。例として、これらのプロセスにはcDNA合成に先立ち効果的なgDNA除去が含まれています。
• 革新的なREPLI-g SensiPhi DNA PolymeraseがMultiple Displacement Amplification（MDA）に使用されています。この酵素は新しく開発された高アフィニティー酵素であり、反応ミックスにおけるcDNA濃度が低い時に特に効率的にcDNAに結合します。さらに、PCRをベースにした方法とは対照的に、REPLI-g SensiPhi DNA Polymeraseは、強力なプルーフリーディング活性を有しており、取り込みエラーが1/1000抑えられます。また、本酵素は強力な鎖置換活性を有し、Taqを用いた全ゲノムまたは全トランスクリプトーム増幅方法では反応しない安定したヘアピン構造からもcDNA複製が可能です。

• 細胞溶解：シングルセルサンプル（1～1000個の細胞を含む）は5分以内に効率的に溶解され、RNAの完全性に影響を与えません。溶解したサンプルはトータルRNA、あるいはmRNA—濃縮（poly A+）RNAのWTAに使用されます。
• cDNA調製：転写レベルの正確な測定は、gDNAコンタミによる偽陽性結果を排除することにかかっているため、細胞溶解後、WTAを実施する前にgDNAを除去します。その後の逆転写反応用に選択したプライマーにより、全転写産物（ランダムおよびオリゴdTプライマーを用いてトータルRNAの濃縮を行なった場合）あるいはポリアデニル化転写産物のみ（オリゴdTプライマーを用いてpoly A+ mRNAの濃縮を行なった場合）が増幅されます。この結果、反応液はランダムプライマーとオリゴdTプライマーの混和物、またはオリゴdTプライマーのみを含有し、rRNAの増幅を抑え、確実にcDNAの3 '末端が逆転写されます（転写産物のサイズは約700～1000 bp）。
• ライゲーション：合成されたcDNAは、効率の高いライゲーションミックスを用いてライゲートされます。続くライゲーション反応の特性により、cDNAフラグメントは細胞内で元々存在していた順序ではライゲートされません。しかし、NGSやqPCRのようなダウンストリームアプリケーションで、スプライシング領域などの核酸配列を検出する際には影響しません。
• 全トランスクリプトーム増幅：ライゲートしたcDNAを、革新的なREPLI-g SensiPhi DNA Polymeraseを用いたMDAテクノロジーを利用して、2時間の等温反応で増幅します。

• プロトコール“Amplification of the 3’ Regions of mRNA (Poly A+) from Single Cells”は、poly A+ tailを持つmRNA（および他のRNA）のみを増幅し、NGS（RNA-Seq）、リアルタイムPCR、およびマイクロアレイ解析を含む幅広いアプリケーションに最適です。
• プロトコール“Amplification of Total RNA from Single Cells”は、poly A+ tailを含有あるいは含有しないRNA、lnc RNA、linc RNAを含む全トランスクリプトームを増幅します。本プロトコールではrRNAも増幅され、増幅後高レベルで存在するため注意が必要です。qPCRあるいはアレイのような配列特異的なプローブを使用する場合、増幅されたrRNAはダウンストリームのアプリケーション結果に影響を与えません。RNA-Seqに増幅したRNAを使用する場合、90％以上のリードがrRNAに由来することに留意してください；従って全トランスクリプトームシークエンシングを実施する際に充分なリードを得る必要があります。
• プロトコール“Amplification of Purified RNA”はトータルRNAあるいは濃縮RNAテンプレートからの全トランスクリプトーム増幅用に至適化され、NGS、リアルタイムPCR、マイクロアレイ解析などの広範囲のアプリケーションに最適です。

REPLI-g WTA Single Cell Kitは、微量サンプルから全転写物の均一な増幅を可能にし、増幅バイアスが非常に少ないあるいは皆無の転写パターンをシングルセルで正確に再現します。プロトコールによりますが、増幅されたcDNAは、次世代シークエンシング（RNA- Seq）、遺伝子発現アレイ、あるいは定量PCR解析での使用に最適です。

REPLI-g WTA Single Cell Kitは以下のような解析のための全トランスクリプトーム増幅に使用可能です：

• poly A+ tailをもつmRNA
• トータル RNA
• RNA転写全領域
• mRNAの3’末端
• Lncおよびlinc RNA

小さい核酸には適していません（例）：

• tRNAおよびmiRNA