REPLI-g Single Cell Kit

シングルセルあるいは限られたサンプル量からの全ゲノム増幅（WGA）

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REPLI-g Single Cell Kit (24)

Cat. No. / ID: 150343

REPLI-g sc Polymerase, Buffers, and Reagents for 24 whole genome amplification reactions (yields up to 40 µg/reaction)

Reactions

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REPLI-g Single Cell Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

シングルセルからの最大のゲノムカバレッジでの全ゲノム増幅
MDA テクノロジーによりゲノム遺伝子座の偏りのない増幅
次世代シークエンシングのような新テクノロジーでの使用に最適
最大40 μg までの一定した収量（増幅産物長さの平均は>10 kb）
がん研究やメタゲノミクスなど、多くのアプリケーションに最適なツール

製品詳細

次世代シークエンシング（NGS）などの革新的テクノロジーを用いてDNA配列解析やジェノタイピングを行なう場合などは限られたサンプル量しか用いることしかできない場合が数多くあります。REPLI-g Single Cell Kitはシングルセル（1,000 個未満の細胞から最低1 個の細菌または腫瘍細胞まで）あるいは精製ゲノムDNAから配列の偏りがなく、最大のゲノムカバレッジで均一にゲノムDNAを増幅するようにデザインされています。新鮮または凍結された組織、および新鮮または乾燥した血液を用いるための追加プロトコールもあります。専用のバッファーと試薬は、ユニークで制御された除染プロセスは、混入DNAの増幅を防ぎ、毎回の信頼性の高い結果を保証します。ごくわずかな配列の偏りとゲノムの欠落がない正確なゲノム増幅が画期的なMultiple Displacement Amplification （MDA）を用いて実現します。 PCR ベースのWGA テクノロジーとくらべて最高1,000 倍の高いフィデリティを示し、偽陽性や陰性の結果を排除します。WGA テクノロジーについては、弊社ウェブサイトの全ゲノム増幅に関する情報ページをご覧になるか、REPLI-g 製品については表4をご参照ください。

パフォーマンス

完全なゲノムカバレッジでNGSやその他のダウンストリームアプリケーションに最適

REPLI-g Single Cell Kitを用いて増幅したDNAの長さは平均 >10 kbであり、カバレッジを最大限にしました。本キットは次世代シークエンシング（NGS）、array comparative genomic hybridization（aCGH）、リアルタイムPCRを用いたアプリケーションを含む様々なダウンストリーム解析でテストされており、これらの用途に最適なキットです（表2）。PCRを利用した増幅ステップを別途に行なう必要がないため、REPLI-g全ゲノム増幅とライブラリ調製にかかる手作業時間を短縮でき、その結果、PCRベースの方法よりも長いリードが得られます（図 " REPLI-g増幅DNAを用いた次世代シークエンシングは、PCRベースの方法よりも手作業時間が短く多くの配列情報を生成"）。精製したゲノムDNAまたはREPLI-g Single Cellで増幅したDNAの両方で、わずか1個のバクテリア細胞を用いた場合でも、同等の高品質なNGS結果が得られ、高い配列カバー率および非常に低いエラー率を示しました（図 “ NGSで同等の結果を実現”）。これらの結果は、すべてのヒト常染色体とX染色体をカバーする広範囲のマーカーを用いた網羅的な解析によっても示され、3つの異なる独立した実験は、ゲノムの全領域からDNAが良好に増幅されたことを実証しています（図 “ 高いゲノムカバレッジ”）。

Table 1. サンプルおよび研究分野
サンプル（細胞／DNA）	研究分野
ヒト／動物	バイオマーカー研究（SNPs、変異、CNV）
	幹細胞研究
	胎児由来の循環細胞解析
	モザイク遺伝研究
	遺伝的素因の研究
	トランスジェニック動物のタイピング
がん	体細胞変異解析
	腫瘍進行
	腫瘍幹細胞／進化
	循環腫瘍細胞の解析
バクテリア	メタゲノム研究
	病原体解析
	微生物ジェノタイピング
植物*	気孔研究
植物*	花粉解析

他社に比べて卓越した性能のREPLI-g Single Cell Kit

他のメーカーが通常採用しているPCRベースのWGA法は、ダウンストリームのプロセスに影響する可能性があるPCRプライマー配列を末端にもつ短い断片を生成します（例；次世代シークエンシング；図" REPLI-g増幅したDNAを用いた次世代シークエンシングは、PCRベースの方法よりも手作業時間が短く多くの配列情報を生成"）。PCRベースのWGA法は、エラーを発生しやすい増幅（結果として単一塩基対変異、STRの短縮および伸長）、またフィデリティが低い酵素Taq DNAポリメラーゼによる遺伝子座の偏りや低い再現性につながることがあります。これとは対照的に、REPLI-g Single Cell Kitはゲノム全体にわたり均一性の高い増幅を実現し、増幅中の遺伝子座の偏りは最小限に抑えられます。REPLI-g Single Cell Kitを含む2種類のMDAテクノロジーを利用したキットおよび2種類のPCRベースのキットの合計4種類のWGAキットで、各キットに特化されたシングルセル増幅プロトコールを用いて配列再現性と遺伝子座の脱落をテストしました。REPLI-g Single Cell Kitとは異なり、他社のキットを用いて解析したシングルセルでは、完璧で偏りのない配列再現性はほとんどの場合得られませんでした（図 “ シングルセルから信頼性が高く偏りのないDNA 増幅を実現”）。

図参照

Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods.

Comparable NGS results.

Complete genome coverage.

Unbiased DNA amplification from a single cell.

原理

REPLI-g Single Cell Kitに含まれるREPLI-g sc Polymeraseは、Multiple Displacement Amplification （MDA）テクノロジーを用いて複雑なゲノムDNAを増幅するために、革新的なハイフィデリティ酵素Phi29 ポリメラーゼを最適化済みで、DNAの断片化や脱塩基部位の形成を防ぐために緩和なアルカリ変性ステップと組み合わせて使用します。本キットは分離したがん細胞やバクテリアなどのシングルセルから高収量でDNAを増幅するために特化されています（表1）。さらに、様々な臨床および非臨床研究サンプルや精製ゲノムDNAと共に使用することができる一方、鮮血、乾燥血液や新鮮・凍結組織で使用する追加プロトコールも入手可能です。典型的なDNA収量は、スタートテンプレート量に関係なく一貫して40μgに達し、DNA濃度を測定せずにその後の遺伝子解析を実施できます。増幅産物の平均長が10 kbを超え完全なゲノムカバレッジを持つことから、REPLI-g Single Cell Kitで増幅したDNAは、次世代シークエンシング（NGS）、アレイを利用したComparative Genome Hybridization（アレイCGH）、パイロシークエンス法、リアルタイムPCR解析（表2）などの様々なアプリケーションに最適です。

表2. ダウンストリームアプリケーションと装置
アプリケーション	装置
全ゲノムシークエンス	次世代シークエンスプラットフォーム^†
エクソームシークエンス	次世代シークエンスプラットフォーム^†
SNPジェノタイピングアレイ	アレイプラットフォーム^†
アレイCGH	アレイプラットフォーム^†
qPCR/PCR テクノロジー	リアルタイムPCR/PCR サイクラー^†
サンガーシークエンス	キャピラリーシークエンサー^†
パイロシークエンス	PyroMark（QIAGEN）

増幅原理

REPLI-g Single Cell KitはMultiple Displacement Amplification（MDA）と呼ばれる等温ゲノム増幅を使用しています。これは変性DNAにランダムヘキサマーを結合し、次に最適化された強い鎖置換の特性を持つPhi29 ポリメラーゼを用いて一定の温度で鎖置換合成を行ないます。テンプレートとして機能する各置換鎖で追加のプライミングが起こり、高収量の増幅DNAが得られます（図“ Multiple Displacement Amplification（MDA）technology”）。ファージ由来の酵素であるPhi 29 ポリメラーゼは、3 '→5'エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）を有するDNAポリメラーゼで、Taq DNAポリメラーゼに比べて1000倍も高いフィデリティを実現します。ユニークで最適化されたREPLI-g Single Cellバッファーにより、Phi29ポリメラーゼはヘアピンループなどの二次構造を容易に解離し、それによって増幅中のポリメラーゼのスリッピング、停止、解離を防止します。これにより100 kbまでのバイアスのないDNAフラグメントの生成が可能です（図" Phi29ポリメラーゼでバイアスのない増幅”）。

細胞溶解とDNAのアルカリ変性

酵素による増幅を行なう前にゲノムDNAは高温（熱インキュベーション）または高pH（化学的アルカリ性インキュベーション）でのインキュベーションのような過酷な方法を使用して変性させる必要があります。REPLI-g Single Cell Kitは穏やかなアルカリ性インキュベーションを使用し、細胞の溶解とDNAのフラグメント化や脱塩基部位が非常に少ない均一なDNA変性を可能にします。この結果、非常に高い整合性をもつ増幅DNAが得られ、増幅されたフラグメントの長さを最大限に引き出し、ゲノム遺伝子座と配列が均一に表現されます（図" 熱およびアルカリによる変性の遺伝子座への影響"）。

検出可能なDNAコンタミを効率的に除去

すべてのREPLI-g Single Cell Kit は、REPLI‑g で増幅可能なDNAコンタミ除去を確実にするため制御された独自の方法で夾雑核酸を取り除きます。バッファーおよび試薬は、検出可能な残留コンタミDNAが存在しないことを確保するため、革新的で標準化された方法によりUV照射を実施しています（図 “ 画期的な残留DNAの除去”）。このUV処理後に、完全な機能性を確実にするためにキットの品質管理を厳密に行ないます。

図参照

Multiple Displacement Amplification (MDA) technology.

Unbiased amplification with Phi29 polymerase.

Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.

Innovative decontamination procedure.

操作手順

簡便な1チューブでの操作

REPLI-g Single Cell Kitは簡便で信頼できるシングルセルや限られた量のサンプルからの正確なゲノム増幅を行なえます。簡便な反応セットアップとわずか15分のマニュアルでの作業時間により、わかりやすく信頼できる手法となっています（図“ REPLI-g Single Cell Kit操作手順”）。専用のバッファーおよび試薬は、シングルセル、限られた量の組織サンプル、精製DNAから、高い配列再現性と偏りのない増幅で高純度な全ゲノム増幅DNAを実現するように開発されています（表3）。 REPLI-gで増幅されたDNAは–20°Cで問題なく長期保存できます（図 " Consistent long-term stability"）。 REPLI-g製品のラインナップと特徴の概略は表4をご参照ください。

表3. REPLI-g Single Cell Kit 構成
キット構成品	利点
REPLI-g sc Polymerase	最長70 kbまでの長いフラグメント
	Taqよりも1,000倍高いフィデリティ
	高い配列再現性
	全遺伝子座で均一な増幅
REPLI-g sc Reaction Buffer^‡	偏りのない増幅と全遺伝子座の再現に最適化
Buffer DLB（溶解と変性）	増幅のための効率的な調製
Buffer DLB（溶解と変性）	DNAを損傷しないプロセス
UVによるコンタミ除去プロセス	検出可能な残留DNAコンタミを確実に除去

表4. 各種REPLI-g Kitの特徴
	REPLI-g Single Cell	REPLI-g Mini	REPLI-g UltraFast Mini	REPLI-g Midi	REPLI-g Screening	REPLI-g FFPE	REPLI-g Mitochondrial DNA
スタートサンプル	シングルセル、gDNA	精製gDNA、血液、細胞			精製gDNA、血液、細胞	FFPE組織、FFPE組織から精製したgDNA	精製gDNA
スタートサンプル	（その他のスタートサンプルのプロトコールはwww qiagen.comをご覧ください）				精製gDNA、血液、細胞	FFPE組織、FFPE組織から精製したgDNA	精製gDNA
使用量	シングルセル、2～1000個、組織、精製gDNA（1～10 ng）	>10 ng gDNA、0.5 µl 血液または細胞（>600 細胞/µl）			>10 ng gDNA、0.5 µl 血液または細胞（>600 細胞/µl）	切片（1 cm diamter, 10～40 µmの厚さ）； >100 ng gDNA	>1 ng 精製gDNA
収量（µg/reaction）	40	10	7～10	40	8	標準収量：≤10；高収量：≤40	3～5
反応時間（時間）	8～16	10～16	1.5	8～16	12～16	標準収量：4 ；高収量：10	8 時間
作業時間（分）	15	15	15	15	15	40	15
フォーマット	チューブ	チューブ	チューブ	チューブ	プレート	チューブ	チューブ

図参照

REPLI-g Single Cell Kit procedure.

Consistent long-term stability.

アプリケーション

REPLI-g Single Cell Kitを用いて増幅したDNAは以下のダウンストリームアプリケーションに使用できます：

次世代シークエンシング
TaqManプライマー／プローブセットを用いたSNPジェノタイピング
qPCR および PCRベースの変異解析
STR／マイクロサテライト解析
サンガーシークエンス
パイロシークエンス
Comparative Genome Hybridization（CGH法）などのアレイテクノロジー

裏付けデータと数値

Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.

リソース

Accelerate your NGS performance through Sample to Insight solutions

This protocol is optimized for whole genome amplification from biopsies using the REPLI-g Single Cell Kit.

This protocol is optimized for whole genome amplification from flash-frozen tissue samples using the REPLI-g Single Cell Kit.

This protocol is optimized for whole genome amplification from buccal cells using the REPLI-g Single Cell Kit.

Purification of DNA after whole Genome amplification using the REPLI-g Single Cell Kit

For whole genome amplification from single cells, limited samples, or purified genomic DNA

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

FAQ

The REPLI-g Whole Genome Amplification (WGA) method is a rapid and reliable method of generating unlimited DNA from a few cells or a few nanograms of genomic DNA. This technology amplifies the genome with comprehensive loci coverage and minimal bias between any loci, yielding 12+ kb fragments in a simple, scalable reaction.

FAQ ID -654

The REPLI-g amplified products can be used directly for downstream analysis such as PCR, PCR-based applications, restriction enzyme digestion, cycle sequencing, and more, after appropriate dilution to adjust to work concentrations.

However, to determine DNA concentration by absorbance, the MDA product should be run through a spin column to eliminate the random hexamers, as they will contribute to the absorbance reading and give an artificially high concentration. For this reason, we recommend determining DNA concentration by PicoGreen analysis, which preferentially binds double-stranded DNA. As a result, single-stranded random hexamers will not contribute to the apparent DNA concentration in the quantitation assay. When using this method, the concentration of the MDA product can be determined directly, without any purification.

A Protocol for the use of PicoGreen to quantitate REPLI-g WGA product can be found in the REPLI-g Mini/Midi Handbook. Please follow this link .

FAQ ID -713

These regions are not amplified because only a subset of the random primers in the REPLI-g amplification mix can prime within these extensively repeated regions. Despite the high processivity of the Phi29 DNA Polymerase, centromeres and telomeres are at a competitive disadvantage during amplification, and drop out. In experiments we have done, single copy sequences within approximately 5000 bases of a poorly amplified region can be affected during amplification. If your gene is further than 5000 bases apart from a centromere or telomere, it should be amplified just fine.

FAQ ID -702

Yes. Chromosomes are equally amplified. We and our customers use amplified DNA for SNP genotyping on a regular basis, using Illumina, TaqMan®, Sequenom, PCR, gel-based sequencing, and other techniques. Tzvetkov et al. (2005) used Affymetrix’ GeneChip Human Mapping 10K Arrays to investigate the accuracy and allele amplification bias in DNA samples subjected to MD-WGA with REPLI-g. They observed an excellent concordance (99.95%) between single-nucleotide polymorphisms (SNPs) called both in the nonamplified and the corresponding amplified DNA. Genomic DNA for this study was extracted from blood samples of four unrelated donors using the QIAamp DNA Blood Kit. High-throughput microarray genotyping of 11 555 different SNPs was performed using GeneChip Human Mapping 10K Arrays version Xba131 (Affymetrix).

For additional references, please visit our continuously expanding Citation Data Base online.

See trademarks.

FAQ ID -700

These are DNA primers of random sequence, six nucleotides long, with two thiophosphate linkages at the 3' terminus to prevent digestion of the oligos by the 3' to 5' exonuclease activity of Phi29 Polymerase.

FAQ ID -710

The reaction works at 30^oC and will not work efficiently at higher temperatures. This is because the Phi29 DNA polymerase is not a thermostable enzyme and the random hexamer primers bind less efficiently as temperature is increased.

FAQ ID -656

Since REPLI-g amplification products contain single-stranded DNA as well as residual primers, it is important to utilize a DNA quantification method that is specific for double-stranded DNA. PicoGreen is a fluorescence-based nucleic acid quantitation method that is specific for double-stranded DNA and may be used to quantify the double-stranded REPLI-g products. For best results, the sample should be diluted with 2 volumes of water and thoroughly mixed prior to addition of PicoGreen.
before taking an OD reading on a spectrophotometer the reaction product must be purified as it contains unused primers and dNTPs

FAQ ID -694

A DNA decontamination process is performed on the REPLI-g sc polymerase and REPLI-g buffers.

Paez et al. 2004 have shown in direct sequencing experiments sampling 500 000 bp, that the estimated error rate (9.5 x 10^-6) was the same in WGA generated samples as in paired unamplified samples.

FAQ ID -701

The REPLI-g kit is designed for whole genome amplification using random hexamers. Addition of specific primers instead of random hexamers may introduce amplification bias, or the preferential amplification of specific DNA fragments at the expense of others. Currently, specific primers alone cannot be used to amplify a specific region of the genome with REPLI-g.

FAQ ID -712

After the REPLI-g reactions are completed, 1 ug of the WGA reaction product can be analyzed by electrophoresis through a 1.0% agarose gel in TBE buffer (90 mM Tris-borate, pH 8.0, 2 mM EDTA), stained with GelStar, ethidium bromide, or SYBR Green, and imaged with a UV-box or a Phosphor-Imager. The majority of product should be above 10 Kb in length, and generate a trail of smear by electrophoresis down to about 2 Kb.

FAQ ID -695

Phi29 DNA polymerase is a high fidelity proofreading enzyme and assures a very low replication error rate. It has an error rate of 1 x 10^-6 - 10^-7 nucleotides both in its intrinsic enzymatic activity and during the amplification reaction.

In contrast, Taq DNA polymerase has an intrinsic error rate of approximately 2 x 10^-5 nucleotides, with an accumulation of about one mutation per 900 bases after 20 PCR cycles.

FAQ ID -707

We have been conducting an ongoing stability study for more than a year without observing breakdown of the amplified product. There is nothing in the amplification product that indicates that it would not be stable for a number of years.

FAQ ID -693

The enzyme used in the REPLI-g reaction is Phi29 DNA Polymerase.

FAQ ID -704

DOP (Degenerate Oligonucleotide-primed PCR) and PEP (Primer Extension Preamplification) are PCR-based whole genome amplification (WGA) methods. REPLI-g amplification uses MDA (Multiple Displacement Amplification) which is not a PCR-based method. MDA is scalable with yields adjustable from ug to mg quantities, whereas DOP typically yields 2-3 ug of DNA per reaction. DOP also generates a shorter product which is not suitable for certain downstream applications (e.g. Southern blot and sub-cloning).

DOP and PEP products are different from REPLI-g MDA products for a number of reasons. First, after amplification is complete, PEP products have active thermostable polymerase that will degrade the amplification product over time, because the polymerase cannot be inactivated. Second, PEP reactions consist of PCR amplicons which have the potential to contaminate other reactions as 'runaway amplicons' (e.g., amplicons in the aerosol that may be co-amplified if they accidentally get into other reactions).

REPLI-g product has neither of these issues. The polymerase is heat-inactivated after the REPLI-g reaction is complete, so it cannot digest the amplified product. There are no issues with 'runaway amplicons', because the reaction is performed at constant temperature by a hyper-branching amplification mechanism, amplifying the genome randomly without generating specific amplicons.

FAQ ID -665