デジタルPCR用miRCURY LNA miRNA PCR Assays

• miRBaseのフルカバレッジにより、あらゆる生物のmiRNAプロファイリングが可能
• 比類のない感度により、わずか1 pgのトータルRNAからmiRNAの定量が可能
• 高い特異性により、密接に関連するmiRNAや成熟miRNAと前駆体を識別可能
• 迅速かつシンプルな2ステップdPCRプロトコールは3時間未満で完了
• QIAcuity装置とQIAcuity EG PCR Kitを使用するdPCRによるmiRNA発現変化の絶対定量

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、非常に高感度で特異的なmiRNAの定量を可能にする個別のmiRNA PCRプライマーセットです。フォワードおよびリバースPCR増幅プライマーはいずれもmiRNA特異的であり、LNA技術で最適化されています。アッセイはチューブ形式で提供され、Nanoplate 8.5kでは166回の反応（1反応あたり12 μl）、Nanoplate 26kでは50回の反応（1反応あたり40 μl）に十分なプライマーが含まれています。上流のcDNA合成ステップはmiRCURY LNA RT Kitで行われ、デジタルPCR増幅はQIAcuity EG PCR Kitを使用してQIAcuity装置で行われます。

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QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用するデジタルPCR分析の最適化

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、高特異性ターゲットの増幅を行うために開発されました。これは、標準リアルタイムサーマルサイクラーを使用するqPCRと、QIAcuity装置およびQIAcuity EG PCR Kitを使用するデジタルPCRの2つのPCR法によって定量できます。miRCURY LNA RT Kitを使用してcDNAを合成後、デジタルPCRにより、非常に正確にターゲットを定量し、最低濃度での最小発現変化さえも検出します。主要なmiRNAのサブセットは、QIAcuity装置で実験的に検証されています。

PCR性能を向上させるLNA

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、厳密な設計基準とラボで検証済みのアルゴリズムを用いて開発されています。厳格なアッセイ選択プロセスにより、各プライマーセットはこの上ない特異性と効率をもたらし、極めて信頼性が高く正確な結果が得られます。T_m-正規化とLNA強化により、このプライマーは標準DNAプライマーよりも高い結合親和性を示し、アッセイの感度と特異性が劇的に向上します。

ステムループか標準DNAプライマーのいずれかを使用する他のmiRNA PCRシステムに比べ、LNA強化プライマーでは、特にATリッチなmiRNAに対する感度が大幅に向上します。

miRNAプロファイリングのためのユニークなシステム

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、ユニバーサルRTとLNA PCR増幅を組み合わせることにより、microRNA PCR市場に性能と使いやすさの最高の組み合わせを提供します（ miRCURY LNA miRNAデジタルPCRシステム概略図を参照）。ユニバーサルRTにより、1つの第1鎖cDNA合成反応を複数のmiRNA real-time PCRアッセイのテンプレートとして使用できます。これにより、貴重なサンプルを節約し、技術的なばらつきを減らし、研究室で費やす時間を節約できます。さらに、フォワードおよびリバースPCR増幅プライマーはいずれもmiRNA特異的であり、LNAに最適化されています。これにより、1）並外れた感度と非常に低いバックグラウンドがもたらされ、非常に低いレベルのmiRNAの正確な定量が可能になり、2）密接に関連するmiRNA配列を識別できる非常に特異的なアッセイが可能になります。

QIAcuity NanoplatesでのdPCR反応の原理については、こちらで説明しています。

カバレッジ（Coverage）

miRBase 20のすべての生物をカバーする20,000を超えるアッセイが利用可能です。1,200を超えるアッセイは、合成サンプルとさまざまな生物学的サンプルの両方で、感度、特異性、効率、バックグラウンドに対して完全にウェットラボ検証済みです。残りのアッセイは、各生物内で最適の感度と特異性を備えた高品質で種特異的なLNA強化アッセイを保証する包括的な設計アルゴリズムを使用してコンピューター検証されています。つまり、いくつかの異なるアッセイが同じ配列をターゲットとする可能性があるということです。最終的には、各種のアッセイが、生物の遺伝的背景に基づいて選択されます。NGS実験から得られたような新規miRNAを扱う場合、あらゆるmiRNAに対応するカスタム設計されたLNA miRNAプライマーセットもご利用になれます。

正規化のためのリファレンス遺伝子アッセイ

検証済みの5つのリファレンス遺伝子プライマーセットがdPCRに利用可能であり、高品質のデータ正規化と、さまざまなサンプルタイプから信頼できるデータ生成が可能です（下の表を参照）。このようなControl primer setは、さまざまなヒト組織で構成的かつ比較的に安定して発現する内因性の小さなノンコーディングRNAをターゲットにしています（ さまざまなヒト組織におけるリファレンス遺伝子の発現レベル図を参照)。コントロールリファレンス遺伝子は、さまざまなmiRNA発現レベルで正確かつ確実に正規化する可能性をもたらします。詳細については、 miRCURY PCRコントロールページを参照してください。

利用可能なリファレンス遺伝子アッセイのリスト

* デジタルPCRでの使用が検証されています。

プレート方式のシンプルで迅速なワークフロー

パーティショニング、サーマルサイクル、イメージングを1つに統合した完全自動化装置が2時間未満で結果を提供します。ナノプレート方式はフロントエンドのサンプル調製の自動化に適しており、手作業時間をさらに短縮できます。

qPCR実験と同様に、サンプル調製では、希釈したサンプルを96ウェルまたは24ウェルナノプレートに移し、マスターミックスとプライマーを添加します。このシステムは、パーティショニング、サーマルサイクル、イメージングを1つに統合した完全自動化装置で、サンプルから結果までのステップを3時間未満で完了させます。Suite Softwareでリモート解析を行うことができ、ターゲット配列の1マイクロリットルあたりのコピー数の濃度や内蔵品質管理オプションも提供されます。　

miRCURY LNA miRNA PCR AssaysをQIAcuity Digital PCR Systemと組み合わせると、成熟miRNA定量のためのデジタルPCR解析が可能になります。