QIAGEN Multiplex PCR Kit

至適化なしに特異性および感度の高いマルチプレックスPCR

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QIAGEN Multiplex PCR Kit (100)

Cat. No. / ID: 206143

For 100 x 50 µl multiplex PCR reactions: 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (providing a final concentration of 3 mM MgCl₂, 3 x 0.85 ml), 5x Q-Solution (1 x 2.0 ml), RNase-Free Water (2 x 1.7 ml)

Product

QIAGEN Multiplex PCR Kit (100)

QIAGEN Multiplex PCR Kit (1000)

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QIAGEN Multiplex PCR Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

至適化不要
ホットスタート導入により高い特異性と感度
様々なマルチプレックスPCR アプリケーションに最適
操作が簡単でかつ経済的

製品詳細

QIAGEN Multiplex PCR Kitは即使用可能なマスターミックス・フォーマットとしてお届けします。QIAGEN Multiplex PCR Kit には、HotStarTaq DNA Polymerase の入ったQIAGEN Multiplex PCR Master Mix、およびFactor MP を含むPCR バッファーが添付されています。至適化済みの塩濃度とともに、Factor MP は特異的に結合したプライマーを安定化し、至適化なしに反応液中の全プライマーで効率的なエクステンションを実現します。増幅困難なテンプレート（GC リッチ）用に画期的なQ-Solution も添付されています。

パフォーマンス

QIAGEN Multiplex PCR Kitは他社に比べて高性能で、特異性と感度の高いマルチプレックス増幅を実現します（図“ 16plex PCR成功例 ”）。本キットはトランスジェニック生物のタイピング（図 " トランスジェニック・マウスのジェノタイピング"）やマイクロサテライト解析（図 " マイクロサテライト解析成功例 "）などの様々なタイプのアプリケーションに最適です。マスターミックス中のHotStarTaq DNA Polymeraseは複数のターゲットを同時に効率的に増幅します。マスターミックスに入っている画期的なPCRバッファーにより、増幅効率はさらに改善されています。ユニークなバッファーは、最適化の必要性を最小限に抑え、広範のPCR条件で特異性の高いPCRを実証します。GCリッチなテンプレートを増幅するために添加されているQ - Solution（キットに付属）により、不適切なPCR条件を改善することができます。

HotStarTaq DNA Polymerase 詳細データ

濃度：5 units/µl
組み換え酵素：Yes
基質アナログ：dNTP、ddNTP、dUTP、biotin-11-dUTP、DIG-11-dUTP、 fluorescent-dNTP/ddNTP
エクステンション速度：72℃ で2～4 kb/min　
半減期：97℃で10分、94℃で60分　
増幅効率：≥10⁵ 倍
5'–>3' エキソヌクレアーゼ活性：Yes
余分なA付加：Yes
3'–>5' エキソヌクレアーゼ活性：No
ヌクレアーゼの混入：No
RNaseの混入：No
プロテアーゼの混入：No
自己プライマー活性：No

図参照

Successful 16-plex PCR.

Genotyping transgenic mice.

Successful microsatellite analysis.

原理

QIAGEN Multiplex PCR Kit はマルチプレックスPCR用に特別に開発された初めてのキットで、使い易いマスターミックスフォーマットが添付されています。QIAGEN Multiplex PCR Master Mixには前もって至適化された濃度のHotStarTaq DNA Polymerase、MgCl₂、dNTPsおよびマルチプレックスPCR反応用に特に開発したPCRバッファーが含まれています。本キットでは最初のマルチプレックスPCR実験で良好な結果を実現します。以下のような最適化済みの試薬や酵素により、本キットでは反応条件（例；プライマー、Mg²⁺、Taq DNA polymeraseの濃度）およびサイクリングパラメーターの至適化は不要です。

HotStarTaq DNA Polymerase

HotStarTaq DNA PolymeraseはTaqDNA polymeraseを化学的に修飾したもので、常温では活性がありません。これにより、低温でのPCRセットアップや最初のPCRサイクルで非特異的な増幅産物およびプライマーダイマーの形成を防ぎます。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。

Multiplex PCR Buffer

この特殊なバッファーは最適な配合比のK⁺とNH₄⁺、ならびに革新的なPCR添加物であるFactor MPが入っています。これはテンプレート周辺でのプライマー濃度を高めます。K⁺ や他の陽イオンと共に、Factor MPは特異的に結合したプライマーを安定化し、HotStarTaq Plus DNA Polymerase による効果的なプライマー・エクステンションを可能にします（図“ 安定で効率的なプライマー・アニーリング”）。画期的なバッファーは、各PCR ステップのアニーリングステップ中でプライマーの特異的結合の割合を非特異的結合に対して高めることにより、各PCRサイクルの特異的な増幅を実現します。このバッファーはユニークな配合比のKClと (NH₄)₂SO₄を含み、従来のPCRバッファーに比べ、幅広いアニーリング温度やMg²⁺濃度の範囲で厳密で特異的なプライマー・アニーリングを実現します。従って、異なるアニーリング温度あるいはMg²⁺ 濃度を用いて行なうPCRの至適化は最小限ですみ、または不要なこともあります。

Q-Solution

HotStarTaq DNA Polymeraseに添付されている画期的なPCR添加剤であるQ-Solution は、DNA の変性環境を改善し、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬により、高度な二次構造をもつテンプレートやGC リッチなテンプレートなどにより生じる不適切なPCR 条件が改善されることがあります。Q-Solutionは、DMSOのような通常使用される他のPCR添加物とは異なり、毒性がなく、一定の濃度で使用でき、PCRの正確性を損なわずにPCR純度を確保します。

図参照

Stable and efficient primer annealing.

操作手順

QIAGEN Multiplex PCR Kit にはすでに至適化され即使用可能なマスターミックスが添付され、さらに使いやすくなっています。マスターミックスを使用すると、時間の節約、反応セットアップの簡略化、ピペッティングエラーやコンタミの発生源排除による再現性向上を実現します - ピペッティング操作は最小限に抑えられ、時間のかかる計算は不要です。プライマートテンプレートのみを添加して最終の増幅ミックスを調製します。マスターミックスは2～8℃で保存できるので、マルチプレックスPCRアッセイのセットアップをさらに迅速に行なえます。キットに付属の詳細なプロトコールは、迅速で容易なPCRセットアップを実現します。反応は室温で設定することができるので、使いやすく便利です。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。

アプリケーション

QIAGEN Multiplex PCR Kitは様々なタイプのアプリケーションに最適です。

トランスジェニック生物のタイピングと解析
マイクロサテライトの増幅と解析
バクテリアおよびウイルスのタイピングと検出
SNP解析用に複数のDNA領域の増幅

裏付けデータと数値

Successful 16-plex PCR.

Multiplex PCR of 16 targets (99–955 bp) was carried out for 35 cycles using standard conditions for the QIAGEN Multiplex PCR Kit, without further optimization or using a variety of conditions with a hot-start DNA polymerase from Supplier A_II. [A] Comparison using 2.5 units per 50 µl reaction of the hot-start DNA polymerase from Supplier A_II and with the indicated Mg²⁺ concentrations. [B] Comparison using the optimized Mg²⁺ concentration (3.5 mM) for the hot-start DNA polymerase from Supplier A_II (part A) and the indicated amounts of enzyme per 50 µl reaction. Successful results were ensured with the QIAGEN Multiplex PCR Kit. M: markers.

Specifications

Features	Specifications
Applications	PCR, RT-PCR, multiplex PCR, typing, detection
Enzyme activity	5' -> 3' exonuclease activity
Reaction type	PCR amplification
With/without hotstart	With hotstart
Single or multiplex	Multiplex
Real-time or endpoint	Endpoint
Mastermix	Yes
Sample/target type	Genomic DNA and cDNA

リソース

Second edition — innovative tools

Addressing critical factors and new solutions

For fast and efficient multiplex PCR without optimization

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

Publications

Screening for clinically significant non-deletional alpha thalassaemia mutations by pyrosequencing.

Haywood A; Dreau H; Timbs A; Schuh A; Old J; Henderson S;

Ann Hematol; 2010; 89 (12):1215-21 2010 Jun 22 PMID:20567827

Pyrosequencing-based strategy for a successful SNP detection in two hypervariable regions: HV-I/HV-II of the human mitochondrial displacement loop.

Anjum GM; Du W; Klein R; Amara U; Huber-Lang M; Schneider EM; Wiegand P;

Electrophoresis; 2010; 31 (2):309-14 2010 Jan PMID:20084631

In vitro analysis of huntingtin-mediated transcriptional repression reveals multiple transcription factor targets.

Zhai W; Jeong H; Cui L; Krainc D; Tjian R;

Cell; 2005; 123 (7):1241-53 2005 Dec 29 PMID:16377565

Isolation of genomic DNA from buccal swabs for forensic analysis, using fully automated silica-membrane purification technology.

Hanselle T; Otte M; Schnibbe T; Smythe E; Krieg-Schneider F;

Leg Med (Tokyo); 2003; 5 Suppl 1 :S145-9 2003 Mar PMID:12935575

FAQ

The concentration of the agarose gel for separation of multiplex PCR products should be appropriate for the overall size of products generated and can be adjusted for resolving small size differences between PCR fragments. For optimal results, we recommend the use of 1x TAE buffer for preparation and running of the gel. Use the general guidelines listed in the table below for choosing the percentage of agarose.

Minimum difference in size of PCR products	Maximum size of fragments	Concentration of agarose
>200 bp	2000 bp	1.3%
>100-200 bp	1000 bp	1.4-1.6%
>50-100 bp	750 bp	1.7-2.0%
20-50 bp	500 bp	2.5-3.0%
<20bp*	250 bp	3.0-4.0%

*Efficient separation of PCR products differing in size by about 20 bp is usually possible using standard molecular-biology–grade agarose. For separation of fragments that differ in size by less than 20 bp, we recommend using high-resolution agarose, for example MetaPhor® agarose (FMC Bioproducts). For more information, visit www.cambrex.com.

Please refer to the QIAGEN Multiplex PCR Handbook for additional information, and for details on successful multiplex PCR using the QIAGEN Multiplex PCR Kit.

FAQ ID -800

Both the quality and quantity of nucleic acid starting template affect PCR, in particular the sensitivity and efficiency of amplification. PCR sensitivity and efficiency can be reduced by the presence of impurities in nucleic acid preparations or in biological samples. These PCR inhibitors are completely removed when template is prepared using QIAGEN Kits for nucleic acid purification. Please refer to the Brochure "Maximizing PCR and RT-PCR success" for additional information.

The optimal primer–template ratio has to be determined empirically. If too little template is used, primers may not be able to find their complementary sequences. Too much template may lead to an increase in mispriming events. Generally, no more than 1 ug of template DNA should be used per PCR reaction. As an initial guide, spectrophotometric and molar conversion values for different nucleic acid templates are listed below.

Spectrophotometric conversions for nucleic acid templates

1 A₂₆₀ unit*	Concentration (ug/ml)
Double-stranded DNA	50
Single-stranded DNA	33
Single-stranded RNA	40

*Absorbance at 260 nm = 1

Molar conversions for nucleic acid templates

Nucleic Acid	Size	pmol/ug	Molecules/ug
1 kb DNA	1000 bp	1.52	9.1 x 10¹¹
pUC 19 DNA	2686 bp	0.57	3.4 x 10¹¹
pTZ18R DNA	2870 bp	0.54	3.2 x 10¹¹
pBluescript II DNA	2961 bp	0.52	3.1 x 10¹¹
Lambda DNA	48,502 bp	0.03	1.8 x 10¹⁰
Average mRNA	1930 nt	1.67	1.0 x 10¹²
Genomic DNA
Escherichia coli	4.7 x 10⁶*	3.0 x 10^-4	1.8 x 10⁸**
Drosophila melanogaster	1.4 x 10⁸*	1.1 x 10^-5	6.6 x 10⁵**
Mus musculus (mouse)	2.7 x 10⁹*	5.7 x 10^-7	3.4 x 10⁵**
Homo sapiens (human)	3.3 x 10⁹*	4.7 x 10^-7	2.8 x 10⁵**

* Base pairs per haploid genome

** For single-copy genes

FAQ ID -74

Always start with the cycling conditions specified in the handbook for the QIAGEN Multiplex PCR Kit to guarantee best performance.

FAQ ID -287

No, we do not sell Q-Solution separately. It is available only as a component of the Taq DNA Polymerase, Taq PCR Core, HotStarTaq DNA Polymerase, QIAGEN Multiplex PCR-, and the QIAGEN OneStep RT-PCR Kits.

FAQ ID -204

Yes, please follow the Supplementary Protocol 'Polyacrylamide_gel_analysis_of_oligonucleotides' (PCR03).

FAQ ID -961

Not necessarily. In a lot of cases, the uniquely formulated PCR Buffer provided in the HotStarTag Plus DNA Polymerase, HotStar HiFidelity Polymerase, Taq DNA Polymerase, HotStarTaq DNA Polymerase, and QIAGEN Multiplex PCR Kits provides optimal amplification of specific PCR products. The usefulness of Q-Solution needs to be determined empirically for each primer/template setup, by running parallel PCR reactions with and without Q-Solution under the same cycling conditions.

Q-Solution changes the melting behavior of DNA and will often improve a suboptimal PCR caused by templates that have a high degree of secondary structure or high GC-contents. For more details on the effects of Q-Solution on PCR amplification, please see the Q-Solution sections of the HotStarTaq Plus DNA Polymerase, HotStar HiFidelity Polymerase, Taq DNA Polymerase, HotStarTaq DNA Polymerase, and the QIAGEN Multiplex PCR Handbooks.

FAQ ID -380

The exact composition of the QIAGEN Multiplex PCR Buffer supplied in the QIAGEN Multiplex PCR Kit is proprietary. The buffer contains a specially developed balanced combination of salts and additives to ensure comparable efficiencies for annealing and extension of all primers in the reaction, thereby facilitating the amplification of multiple PCR products in a single tube.

The QIAnews article 'Highly efficient multiplex PCR using novel reaction chemistry' provides additional details and describes the advantages of this buffer in contrast to conventional PCR reagents.

FAQ ID -289

Yes, the Multiplex PCR Master Mix will freeze at -20°C. Freeze-thaw cycles up to 10 times will not negatively influence the performance of the kit. The 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix can also be stored at 2-8°C for up to 6 months.

FAQ ID - 525

Yes. Please see Table 3 in our brochure Maximizing PCR and RT-PCR success. We tested the effects of different inhibitory substances in a number of PCR systems. We also analyzed the effect of including different volumes of reverse transcription (RT) reaction mixtures in PCR. Please see the table below for a list of commonly encountered template impurities and their inhibitory effects on PCR.

Impurities showing inhibitory effects on PCR

Substance	Inhibitory concentration
SDS	>0.005% (w/v)
Phenol	>0.2% (v/v)
Ethanol	>1% (v/v)
Isopropanol	>1% (v/v)
Sodium Acetate	≥5 mM
Sodium Chloride	≥25 nM
EDTA	≥0.5 mM
Hemoglobin	≥1 mg/ml
Heparin	≥0.15 i.U./ml
Urea	>20 mM
RT reaction mixture	≥15%

FAQ ID -818

Yes. Precipitates may form when the buffer freezes. We recommend that you thaw the buffer on ice, then vortex the tube at room temperature until the precipitate has re-dissolved. Do not centrifuge the tube. Do not heat the buffer.

FAQ ID -216

No, the initial activation time of 15 minutes at 95°C is crucial. Enzyme activation will be incomplete when using shorter activation times, resulting in inefficient PCR product amplification.

FAQ ID -565

The DNA yield obtained in a PCR reaction depends on the size of the amplicon, design of the primers, starting amount of template and primers, amplification efficiency, reaction volume, numbers of PCR cycles etc. Therefore it is really difficult to predict what yield to expect. Nevertheless, in our experience, approximately 1 µg is a good guess for most cases.

FAQ ID -750

To determine the optimal annealing temperature for a PCR assay, a Temperature Gradient experiment should be performed. To do this, you will set up several PCR reactions in duplicate for the same primer/template combination, using the same PCR chemistry, and subject each of the reactions to a slightly different annealing temperature within a specified range. If a thermal cycler with a temperature gradient function can be used, you can simply program a temperature range for adjacent wells in the cycling block. If no cycler with a gradient function exists in your lab, you will either have to perform duplicate reactions at different temperatures in different machines (if available), or back to back in the same machine.

FAQ ID -288