Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• 1つの増幅で確立されたSTRの最大の組み合わせ
• European/SWGDAMの最小Yハプロタイプ、CODIS、国際刑事警察機構およびESSの要件を満たします
• 少量のgDNAから完全なプロファイル
• 優れたバランスと高いコールレートで難しいサンプルからアレルを検出します
• 1ラン当たり96個のサンプルを同時にシークエンシングします
• ケースワークのためにNational DNA Index System（NDIS）へのアップロードが承認されています（SEはなし）

ForenSeq MainstAY Product Lineでコア常染色体およびY-STRを標的とし、主流のケースワークや法医学遺伝子系図確認試験で識別性の高いデータを作成するための一番アクセス可能な手段。大部分の全国データベースSTRアップロードをサポートする専用のNDIS承認済みForenSeq MainstAY Kit、または高度に多型のSE33マーカーを含むForenSeq MainstAY SEキットのような2つの地理的に関連するオプションから選択します。ルーチンのヒト個人識別アプリケーションで使用される確立されたSTRに注目し、大規模データベースとの互換性を維持することにより、MainstAY製品は、次世代シークエンシングへの移行を容易にします。よく知られた実証済みのForenSeqワークフローは、2時間足らずのハンズオン操作時間で最大96個までの証拠サンプルについてより包括的なDNAプロファイルを作成します。

ForenSeq MainstAYは、次世代シークエンシング（NGS）をお使いの操作のワークフローに含めるための簡単な移行ポイントを提供します。NGSは、1つの反応でさまざまなカテゴリーのSTRの同時タイピングをサポートし、法医学サンプルから最大限の情報回収を実現します。また、STRの識別力を別のシークエンスレベルの変異と組み合わせ、1つのSTR内で同類アレルを決定できます。ForenSeq MainstAY Kit ForenSeq MainstAY Kitは、27個の上染色体および25個のY-STR遺伝子座を小さいアンプリコンとして増幅する試薬を含み、MiSeq FGx Reagent Micro Kitを使用してMiSeq FGx Sequencing System上でシークエンシングデータを作成します。このワークフローで、Au-STRおよびY-STRのシークエンスとアレルの長さの多型の両方を単一の増幅で同定できます。これにより、複数のワークフローを実行する必要はなくなり、法医学サンプルの情報性の価値を最大化し、それにより含有物の統計力を向上させます。また、NGSは、アレル重複の問題を取り除き、マルチプレックスでより多くのアレルを調べることが可能です。

• STR遺伝子座とアメロゲニンの組み合わせは、ヒト個人識別に有効なツールです
• 世界中の既存データとの互換性を維持します
• 1 ng DNAという少量インプットの推奨により、再現性のある高いコールレートを実現します
• MainstAY Analysis Moduleを使用して、よく知られた使いやすいインターフェイスでシークエンスデータを解析します
• 1日半足らずでレポートを作成します

27個のAu-STR、25 Y-STRおよびアメロゲニンを1つの反応に含めることで、市販されているほとんどの常染色体STRキットよりも高い尤度比が得られ、比較するサンプルのタイピングに使用したアッセイの如何に関わらず、単一ソースのプロファイルの直接比較が可能です（たとえば、データベース検索および国際データ共有で）。ForenSeq MainstAYで作成された遺伝子プロファイルでは、Au-STRでのケースワーク検索ならびにY-STRデータベースでのハプロタイプ検索ができます。Y-STRは、男性のDNAからハプロタイププロファイルを作成し、男性／女性の混合物で作業する場合は、極めて有用になります。1人の男性のDNAだけが関わっている場合、考えられる他の男性を除外するためにも使用できます。

同時にシークエンシング可能なライブラリーの最大数は、1遺伝子座当たりに希望するカバレッジ深度（DoC）またはリード数によって異なります。また、アンプリコン全体にわたるバランスのとれたリードカバレッジは遺伝子座やアレルの回収に重要です。ForenSeq MainstAY Kitでは、単一のシークエンシング反応でマルチプレックスされるマーカーの数は少なく、そのため全体のカバレッジは高くなります。遺伝子座間のバランスは、MainstAYライブラリーを使用して、陽性増幅コントロール、49個の女性のCoriellサンプルおよびNTCも含め、46個の男性のCoriell サンプル由来の1 ngのインプットDNAから決定されました。男性サンプルでのAu-STRおよびY-STR全体にわたる平均カバレッジは、それぞれ669リードと469リードでした。女性サンプルでのAu-STRの平均カバレッジは、1065リードでした。Au-STR間では、最高のカバレッジ深度と最低のカバレッジ深度の差は15倍であり、一方Y-STRでの最高リードと最低リードの差は4.6倍でした（図 “ForenSeq MainstAY Kitに含まれるマーカーの平均DoC”を参照）。男性サンプルでの遺伝子座間のバランスの中間値は、リード合計数のパーセント値で表記され、1.9%でした（Au-STRs: 2.2% およびY-STRs: 1.6%）。女性サンプルでは、Au-STRの遺伝子座間のバランスは、3.7%でした（図 “ForenSeq MainstAY Kitに含まれる性別マーカーについての遺伝子座間バランス”を参照）。

遺伝子座内のバランス（ILB）またはヘテロ接合のバランス（HB）は、ヘテロ接合体ペアについてのより大きい数のアレルリードに対するより小さい数のアレルリードの比として計算します。CEベースのSTRに比べて、NGSは、ライブラリー調製およびシークエンシング時のより小さなアンプリコンに対する増幅バイアスにより、ILBについてはより広い範囲を示します。この試験では各サンプルと遺伝子座について、ヘテロ接合体および同サイズの遺伝子型ペアのILBを、1 ng DNAを使用して評価しました。パネルのすべてのマーカーは、60％を超えるILB値を示し、ILBの中間値は86％でした。ForenSeq MainstAY Kitのカバレッジと低い多様性は、アンプリコンのバランスが良好であり、遺伝子座またはアレルの脱落の可能性を低減し、混合物中のマイナーDNAの同定を改善します（図 ”1 ng DNAインプットでForenSeq MainstAY Kit内に含まれる遺伝子マーカーの遺伝子座内バランス”を参照）。

広範なインプット全体にわたって遺伝子型およびハプロタイプを生み出す能力を、テンプレート量で段階希釈したgDNA（1 ng、500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg、15.625 pg、7.82 pg）を使用してn=3で評価しました。96個のライブラリーを、MiSeq FGx Reagent Micro Kitを使用して同時にシークエンシングしました。ForenSeq MainstAY Kitは、96個のライブラリーを同時にシークエンシングした場合、わずか62.5 pgのインプットDNAで高感度、完全なプロファイルの作成（アレルの喪失なし）および100％のコールレートを提供します。シークエンシングベースの遺伝子型データのアレルのコールレートと比較精度を決定するために、遺伝子型およびハプロタイプを、Universal Analysis SoftwareでMainstAY Analysis Moduleで、デフォルト設定を使用し、従来の遺伝子型決定方法（STRのCEフラグメント長さの検出）からの直交遺伝子型決定データに比較して作成しました。Au-STRは、62.5 pgまで100％の一致を示し、31 pgでさえ95％の一致を示しました。 Y-STRは、125 pgまで100％の一致を示し、31 pgまでは91％の一致を示しました。不一致のコールはすべて1 ngサンプルについてデフォルトのstutterフィルターを超えたstutterの結果でした（図 “リプリケートで増幅した段階希釈gDNAサンプルを使用した感度試験”を参照。）

ForenSeq MainstAY Kitで作成された遺伝子型とハプロタイプの一致を評価するために、NIST SRM 2391d標準、Coriell DNA、陽性増幅コントロール、および3つのNTCを含めた31個のライブラリーを調製し、n=3でシークエンシングしました。データは、Universal Analysis SoftwareでMainstAY analysisモジュールを使用し、デフォルトの分析閾値およびstutterフィルターで分析しました。遺伝子型とハプロタイプのアレルの正確度は、直交CEデータト比較することで決定しました。精度およびコールレートは、併行精度と再現性の実験を使用して決定しました。ライブラリーは、1つの陽性増幅コントロールと3つのNTCと共に15個のコントロールDNAサンプルをn=4で、3台の異なるMiSeq FGx機器で3人の担当者により調製・シークエンシングしました。高い正確度が、Au-STR（99.82%）およびY-STR（100%）で認められました。6つの不一致のアレルが、3261個のAu-STRアレルで検出されました。不一致のアレルは、774個のY-STRアレルでは検出されませんでした。同様に、Au-STRおよびY-STRのそれぞれについて、99.87%および99.42%の高精度率が認められました。食い違いはすべて、デフォルトのstutterフィルターを超えるstutterアレルに起因しました。

ForenSeq MainstAY Kitの、少量の原因物質における小さいアレルを検出する能力を評価するために、コントロールの女性および男性のサンプルの混合物を、女性のサンプルを主なDNA 1 ngで作成しました。混合物内の微量のDNAのパーセント値は、50％から0.2%の範囲でした。混合物中のユニークで、共有されないマイナーアレルDNAのアレル数を、Universal Analysis SoftwareでMainstAY分析モジュールのデフォルト分析閾値および解釈閾値、ならびにstutterフィルターを使用して評価しました（図 “マイナーDNAの段階希釈濃度での女性：男性gDNAコントロールサンプルの混合物”を参照）。50％のマイナーDNAで、31個のユニークなマイナー常染色体アレルおよび27個のYアレルが検出されました。およそ15個のユニークなマイナー常染色体アレル（50%のユニークなAu-STRアレル）および26個のYアレルは5％のマイナーな寄与で検出可能でした。1％のマイナーな寄与で、10個以上のY-STR遺伝子座が検出可能でした。ForenSeq MainstAYは、低レベルの寄与でさえ、混合物内のマイナーDNAの効率的な同定が可能です。

ForenSeq MainstAYワークフローでの分解したDNAの遺伝子型およびハプロタイプのタイピング能力を、環境ストレスや化学的ストレスにさらされた法医学のサンプルを真似た一部分解したgDNAを使用して評価しました。30個のサンプルからの1 ngの分解した血液、1つの陽性増幅コントロールおよびNTCからのライブラリーを、Miseq FGx Reagent Micro Kitを使用してn=3で調製・シークエンシングしました。劣化指数（DI）を使用して、ライブラリーのサンプル品質を評価しました。DIが1–4のサンプルは分解されていないと考え、DIが4–10のサンプルは中程度に分解されていると考え、DIが10未満のサンプルは、重度に分解していると考えました。MainstAYで試験したサンプルのDIは、1～56の範囲で、分解が低レベル、中程度レベル、高レベルにわたっていました。すべてのSTRは、分解のないサンプルで正確にタイピングされました。中程度に分解したサンプルは、正確にタイピングされたSTRの85％を超えるコールレートを示し、その一方で重度に分解したサンプルは、71％を超えるコールレートで、増幅可能なSTRの喪失は最小限であることを示しました。56という最高のDIのサンプルのアレル回収率は60％（40/74）でした。ForenSeq MainstAYは、重度に分解したサンプルからでさえ、高い数値のアレルの検出を可能にします（図 “分解した血液サンプルから抽出されたゲノムDNA”を参照）。

ForenSeq MainstAYワークフローは、Verogenライブラリー調製ポートフォリオを支える、よく知られたForenSeq chemistryケミストリーを基盤としています。この高感度のPCRベースのアッセイは、一体化したユニークデュアルインデックス（UDI）のある53個のマーカーを効率的に増幅し、分解したDNAからのアレルを検出する可能性を高める短いアンプリコンを作成します。DNA抽出物のインプット容量、8 μlは、低濃度のサンプルと阻害されたサンプルの希釈に対する柔軟性をサポートします。

この完全にキット化されたソリューションは、陽性増幅コントロールを含み、購入およびキャリブレーションを容易にします。キットは、MiSeq FGx Reagent Micro Kit上で、MiSeq FGx Sequencing Systemの長いペアエンドのリード能力を用いて、最大96個のサンプルをシークエンシングし、分析することができ、サンプルのスループットを最大化し、サンプル当たりの費用を最小限に抑えます。1 ngのgDNAの少量インプット推奨により、最低62.5 pgの高品質の単一ソースのサンプル、および困難なサンプルから完全なプロファイルの、信頼性が高く再現性のある回収を実現します。

ForenSeq MainstAY Kitは、MiSeq FGx Sequencing System、MiSeq FGx Reagent Micro Kit、Universal Analysis Software（UAS）のMainstAYの分析モジュールと共に使用すると、30時間足らずでエンド・ツー・エンドのワークフローを可能にします。MainstAY Analysis Moduleは、導きのある探索、プロジェクトおよびサンプル表示で豊かな可視化、および広範囲のフィルタリングおよび分類能力を使用したSTRアレルコールの正確なレビューを提供します。さらに、複数の形式でエクスポートできる人が直接読むことのできるレポートを作成します。この一体化したワークフローは、法医学のアプリケーション用のNGSを考慮し、研究室へ費用効果の高い入り口を提供します。

ワークフローには、5つの安全な停止ポイントが含まれ、ライブラリー調製の効率および簡便さを高める事前に混合されたアダプタープレートが含まれます。ワークフローは、抽出gDNA、生の溶解物、FTAなどの保存培地カードパンチといった、法医学DNAでよくあるさまざまなソースに適合します。

• 多量のケースワークのための焦点を絞った効率的な分析

27個の常染色体STRおよび25個のY-STRマーカーを含むよく特性評価された遺伝子座の最大規模のコレクションを最大96サンプルまで同時に調べます。わずか100 pgで既存のSTRデータベースすべてに適合するバランスのとれたプロファイルを作成します。最小限の相互作用の分析モジュールでデータを効率的に分析し、地域のデータベース要件に適合した、すぐアップロードできる幅広いエクスポートオプションから選択します。

• より良質のデータ、同様の費用

コアのCODISおよびEuropean Standard Set（ESS）STR遺伝子座向けに、単一の増幅およびシークエンシングのランで、従来のCE分析と同様の費用で、識別性の高いデータを入手できます。2つのシークエンシングキットサイズの選択で、お使いのスループットの要件が何であれ、次世代シークエンシングの力を解き放ちます。

• 完全に一体化され、サポートされています

エンド・ツー・エンドのワークフローは、確立されたForenSeqプロセスに基づいており、1つの実証済みのプラットフォーム上での非常に広範なDNA解析を実現します。ForenSeq MainstAY Kitは、迅速なデータ評価とワンクリックでのレポート作成のために、UASとシームレスにリンクします。

Universal Analysis Software（UAS）のMainstAY分析モジュールは、よく知られた品質スコア、閾値、ガイダンスを使用して、シークエンシングデータの評価を可能にします。事前に構成された分析設定は、必要性に応じて研究室で変更できるソリューション内で提供されます。さらに、このモジュールは、QCインジケータを使用したマーカー検査を容易にする合理的なプロジェクトおよびサンプルの概観で、大量のサンプルを扱う法医学研究室の操作効率向上のために設計されています。新しい分類およびフィルタリング能力により、さまざまなQCインジケータを使用してSTRサブセットを分類・評価することができます。アレルコールと配列レベルの情報の両方の間で容易にナビゲートする能力により、同類のヘテロ接合体などの混合アレルの集団からSTRアレルの配列分析をより容易にすることが可能になりました。

当社は、ライブラリー調製からシークエンシング、分析まで全ワークフローにわたって優れたサポートを提供します。当社の経験豊富なチームは、お使いの装置、ソフトウェア、バリデーションプラン、および実践のガイダンスのために包括的なサービスを提供し、ワークフローを容易に操作可能にします。