QuantiNova LNA PCR Assays for Digital PCR

• 130万を超えるアッセイにより、Ensemblでヒト、マウス、ラットのmRNAおよびlncRNA転写産物を最も幅広く、可能な限りカバーできます。
• 短いLNA強化プライマーを使用する並外れた感度と特異性
• 1 RNAコピーから始まる広いダイナミックレンジにわたり正確な検出を実現
• 最適化し、非特異的増幅を排除
• QIAcuity装置とQIAcuity EG PCR Kitを使用するdPCRによる発現変化の絶対定量

QuantiNova LNA PCR Assaysは、デジタルPCRベースの遺伝子発現分析に新しい基準を築きます。一般的な転写産物の検出から特異的転写産物アイソフォームの区別に至るまで、ヒト、マウス、ラットのmRNAまたはlncRNAを正確かつ高感度で検出するように事前に設計された幅広いアッセイから選択できます。LNA強化により、より短いプライマーを設計できます。これは、ターゲット上の位置に高い柔軟性を示します。その結果、特異的転写産物検出やターゲットを区別する設計を最適化できます。さらに、徹底的な設計検証により、最適なパフォーマンスと安定した検出結果が保証されます。デジタルPCRでは、QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用してアッセイを最適化し、わずか2時間のシンプルかつ高速の絶対定量ワークフローを作成しました。

qPCR分析にQuantiNova LNA PCR Assaysの使用を計画していますか？qPCR専用製品と性能の詳細は、qPCRカタログページでご覧いただけます。

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QIAcuity EG PCR KitとQIAcuity装置を使用するデジタルPCR分析の最適化

QuantiNova LNA PCR Assaysは、高特異性ターゲットの増幅を行うために開発されました。これは、2つのPCRメソッドで定量できます。標準リアルタイムサーマルサイクラーを使用するqPCRとQIAcuity装置およびQIAcuity EG PCR Kitを使用するデジタルPCRです（デジタルPCRにQuantiNova LNA PCR Assaysを使用する図を参照）。QuantiTect Reverse Transcription Kitを使用してcDNAを合成後、デジタルPCRにより、非常に正確にターゲットを定量し、最低濃度での最小発現変化さえも検出します。重要なアッセイのサブセットは、QIAcuity装置で実験的に検証されています。

PCR性能を向上させるLNA

QuantiNova LNA PCR Assaysは、厳格な設計基準とラボで検証したアルゴリズムを使用して開発されています。厳格なアッセイ選択プロセスにより、各プライマーセットは最高の特異性と効率をもたらし、信頼性と精度が極めて高い結果が得られます。T_m-正規化とLNA強化により、このプライマーは標準DNAプライマーよりも高い結合親和性を示し、アッセイの感度と特異性が劇的に向上します。

この感度の向上により、1 RNA分子まで優れた増幅効率が保証され、少ない出発物質からlncRNAなどの少量のターゲットをより簡単に検出することが可能となります。LNAの適切な配置による特異性の向上により、高い信号対雑音（SN）比が得られ、ひとつのヌクレオチドしか異ならない配列の識別が可能になり、非特異的増幅とプライマーダイマー形成が排除されます。

LNA塩基の高い結合親和性により転写産物へのプライマー配置の柔軟性が向上するため、インテリジェントな位置調整を行って、他の方法では分析が困難なターゲットのアッセイを設計できます。これにより、AUが豊富なターゲット、存在量の少ない転写産物、二次構造が高く、非常に複雑なサンプルのターゲットであっても、優れたターゲット識別と信頼性の高い定量が可能になります。

LNA設計エキスパートを信頼してください

20年にわたるLNA設計の経験により、高度なLNA設計アルゴリズムを開発および最適化することができました。このアルゴリズムには、非常に厳格な性能基準に対して徹底的にラボで検証された50を超えるさまざまなパラメーターが組み込まれており、ターゲット検出の成功を約束する最適なアッセイです。転写産物ごとに最大3つの異なるアッセイ設計を選択し、すべての一般的なmRNAおよびlncRNAターゲットアッセイを完全にウェットラボ検証しました。QuantiNova LNA PCR Assaysは、作業が簡単です。最適化に時間や費用を費やす必要がありません。

EvaGreenベースのデジタルPCR

dPCRによる絶対定量には、QuantiNova LNA PCR Assaysを、EvaGreenベースの蛍光検出を使用するQIAcuity EG PCR Kitと一緒に使用します。EvaGreenは、二本鎖DNA（SYBR^® Greenと同様）に結合し、DNA結合時に蛍光を発するインターカレーター色素です。EvaGreenベースのdPCRを使用すると、製品の増幅と検出に必要なのはプライマーセットのみなので利便性がもたらされ、節約につながります。また、dPCRナノプレートの数千ものパーティションに分割されるdPCR反応でより高い分解能が得られるので、dPCR反応に必要なプライマー濃度はqPCRに必要なプライマー濃度の半分です。

最も包括的で特異的なカバレッジ

弊社が保有するアルゴリズムを使用して、130万を超えるQuantiNova LNA PCR Assaysを設計し、最も感度が高く、正確かつ効果的なmRNAおよびlncRNA分析を提供します。プレデザインのアッセイは、Ensemblデータベース内のヒト、マウス、ラットの多くの遺伝子の転写産物をカバーし、可能な限り詳細なPCRベースの遺伝子発現研究を可能にします。ほとんどのアッセイは、可能な場合はイントロンをはさんでおり、RNAのみを検出します。イントロンをはさまないアッセイはそのように指定されており、ターゲットにエクソンが1つある場合は、統合されたgDNA除去ステップによって、QuantiTect Reverse Transcription Kitを使用して不要な信号を簡単に除去できます。

ターゲットに適したアッセイの選択

事前に設計したQuantiNova LNA PCR Assaysを使用すると、一般的な転写産物の検出、特異的転写産物の検出、または転写産物アイソフォームの区別など、必要な分析レベルに関係なく、ヒト、マウス、ラットのmRNAまたはlncRNAを正確かつ高感度で検出できます。

ほとんどのヒト、マウス、ラットの遺伝子には1つの転写産物しかありませんが、複数の転写産物がある場合は、同じアルゴリズムを使用して、転写産物ごとに最大3つのアッセイを選択しました。このようなアッセイの設計とプライマーの配置は、さまざまな使用要件に応じて異なります。弊社のアッセイ選択ガイドは、各カテゴリーから最適なアッセイをすばやく特定するのに役立ちます。ターゲットのアッセイを検索した後、簡単に結果を確認し、使用目的に一致する推奨アッセイを探します。

• 最良のカバレッジ：一般的な転写産物検出用
• 最良の転写産物アッセイ：特異的転写産物検出用
• 最良の転写産物特異的アッセイ：特異的転写産物アイソフォームを区別

詳細については、以下の表をご参照ください。

デジタルPCRデータの解析

QIAcuity Software SuiteをdPCRデータの解析に使用します。これは遺伝子発現テストを含みます。このテストでは、結果を倍率変化および制御倍率として公開可能な数値で提供します。

任意の試験のためのReference Gene Assays

高品質のデータ正規化を可能にし、信頼できる結果を保証するために機能的に検証した幅広いヒト、マウス、ラットのReference Gene Assayが利用可能です。このようなアッセイは通常、多種多様な組織で構成的に発現する内因性コーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、および核小体低分子RNA分子を対象としています。

mRNA/lncRNA qPCR結果の正規化

正規化により、調査中の生物学的変化とは関係のない技術的および生物学的なサンプル間変動が除去されます。適切な正規化は、real-time PCR実験の結果を正しく分析し、解釈するために重要です。通常、安定して発現する参照遺伝子を正規化に使用します。

実際のmRNA/lncRNA発現解析をセットアップする前に、 いくつかの内因性対照リファレンス遺伝子候補を検証することをおすすめします。このような候補は、調査中のサンプルの全範囲にわたって安定して発現すると考えられる遺伝子から選択する必要があります。リファレンス遺伝子の候補は、文献や既存のデータ（たとえば、NGSやqPCRパネルスクリーニング）に基づいて選択した安定して発現するmRNAまたはlncRNAにすることができます。QuantiNova LNA PCRシステムは、安定して発現する傾向があるため、参照遺伝子候補として適するRNAに検証済み参照遺伝子アッセイを提供します。

すべてのリファレンス遺伝子候補は、各試験で経験的に検証する必要があります。多数のmRNA/lncRNAをプロファイリングするときにPCRパネルを正規化する選択肢の1つは、グローバル平均、つまり発現したすべてのmRNA/lncRNAの平均–に対して正規化することです。これは、コールレートが高いサンプル（発現遺伝子）では適切なオプションですが、コールレートが低いサンプルでは注意して使用する必要があります。また、一般的な遺伝子発現レベルが変化したサンプルでは適切な選択肢ではありません。

2ステップRT-dPCR

QuantiTect Reverse Transcription Kit（カタログ番号 205311、205313、205314）で逆転写を行うと、最良の結果が得られます。QuantiNova Reverse Transcription Kitの使用はおすすめしません。結果として得られたcDNAを、QIAcuity EG PCR Kitのマスターミックスと、選択したQuantiNova LNA PCRアッセイを組み合わせてdPCRによる定量解析を行います。

重要な注釈：アッセイ製品名の後に括弧で示した反応量は、qPCRの使用に関連します。Digital PCRは、半分のプライマー濃度で済みますが反応量は異なります。QIAcuity Nanoplate 26Kを使用の場合、表示と同数の反応を設定できます。Nanoplate 8.5Kを使用すると、3.3倍設定できます。dPCRの指示に対するQIAcuityの使用については、ハンドブックをご参照ください。

出荷と配送

QuantiNova LNA PCR Assaysは常温で出荷します。在庫のアッセイは1–5日以内に配送されます。早期アクセス期間中は、配送時間が長くなると思われます。

QuantiNova LNA PCRシステムを用いたデジタルPCRに必要なもの

逆転写：QuantiTect Reverse Transcription Kit（カタログ番号205311、205313、205314）

dPCRマスターミックス：QIAcuity EG PCR Kit

Assays：

• QuantiNova LNA PCR Assays
• QuantiNova LNA PCR Custom Assays

QuantiNova LNA PCR Assaysは、次のようなアプリケーションに非常に適しています。

• mRNAおよびlncRNAの発現解析、プロファイリング、定量
• RNA-seq遺伝子発現データのバリデーション
• 遺伝子発現プロファイリング
• シグナルとパスウェイの解析
• LNA GapmeRまたはsiRNAによる遺伝子発現ノックダウンの確認
• 疾患関連バイオマーカーのスクリーニング、同定、検証を含むバイオマーカーの開発
• 遺伝子発現に関連する表現型の変化のモニタリング