デジタルPCRで何ができますか?
貴重なサンプルを取り扱っている場合、希少な突然変異を解析している場合や、阻害物質だらけのサンプルを研究している場合、ナノプレートdPCRなら正確で再現性の高いデータを得ることができます。ワークフローは、迅速で自動化され、ばらつきを抑えて一貫性を向上させるだけでなく、シンプルなため、使用するためトレーニングをほとんど必要としません。
デジタルPCR、特にQIAcuityのナノプレートdPCRは、研究者の探求する課題とその答えを根本から変えていくことで研究に革命をもたらし、以前はqPCRやその他のdPCR技術の制限によって滞っていたアプリケーションを再び活発化します。以下で、特定のアプリケーションを使って技術を生かす方法について説明します。
希少な突然変異の検出
希少突然変異検出(RMD)とは、野生型バックグラウンドのプールに非常に低頻度でのみ存在する配列変異体を検出することを意味します(1%未満または0.1%)。したがって、 点突然変異や一塩基多型(SNP)などの希少イベントを検出および定量するには、高感度で正確かつ精密な方法が必要です。困難なのは、一方が他方よりはるかに豊富な2つの非常に類似するシークエンスを区別することです。
ナノプレートdPCRを希少な変異の検出に使用するメリット
- 大量の入力反応ボリュームを26,000のパーティションにロードできるため、希少な標的を見つける確率が著しく向上
- 突然変異と野生型シークエンシングをマルチプレックス化して、大量の野生型バックグラウンドに対して、少量の希少突然変異分子を検出可能
臨床試験および腫瘍学研究のためのQIAcuity ソリューションの詳細
コピー数多型解析
コピー数多型(CNV)解析では、個人のゲノムの特定の遺伝子のコピー数を測定します。遺伝子はゲノムごとに2つのコピーが存在することが知られています。しかし、この遺伝子は、場合によってはより多く存在することがあります。遺伝子増幅(がん遺伝子を活性化する)と欠失(腫瘍抑制遺伝子を不活性化する)は、点突然変異、転座、逆位などのゲノム変化に加えて、がん関連遺伝子に影響を与える重要なコピー数変化(CNA)です。CNAの影響を受けるほとんどのがん関連遺伝子は、発がんとがんの進行に関与するがんシグナル伝達経路の重要な遺伝子と定義されています。 CNV は、遺伝的多様性(遺伝子座の欠失や重複)の重要な源であり、一般的な神経疾患や自己免疫疾患、遺伝子疾患、有害な薬物反応に関連する遺伝子の研究を可能にします。
ナノプレートdPCRをCNV解析に使用するメリット
- CNVの1.2倍未満の変化を検出し、約2時間で結果を出す
- 8.5Kナノプレートのもつマルチプレックス機能、または26Kナノプレートを使用した連続コピー数状態のさらに細かな区別により、dPCR CNV解析の経済性とスループットレベルが向上
- QIAcuity Software Suite でCNVを自動計算でき、オリジナルアッセイの設計も可能
リキッドバイオプシー
リキッドバイオプシーは、液体生検または液相バイオプシーとも呼ばれ、 非固形の生体組織、主に血液のサンプリングと解析が行われます。主に、がんなどの疾患の診断とモニタリングのツールとして使用されます。リキッドバイオプシーは、組織生検と比較してドナーにとって低侵襲です。腫瘍細胞が死ぬと、ctDNAを血中に放出します。ctDNAのがん患者の変異は、従来の腫瘍生検で見られる変異を反映しており、疾患追跡の分子バイオマーカーとして使用できます。課題は、血液中の腫瘍細胞由来のctDNAの濃度が低いことです。王道は、NGS、パイロシークエンス、またはreal-time qPCRを使用することですが、このようなメソッドの弱点は、LODの限界です。腫瘍組織のパイロシークエンスは約10%、NGSは1~5%で、qPCRは1%まで検出できますが、そのため、検出レベルの限界によって、ドナーの残存病変のモニタリング中に変異を見落とす可能性があり再発する可能性があるという問題が生じます。
ナノプレートdPCRをリキッドバイオプシーに使用するメリット
- 最大28 µlのサンプル量をロードしてLODを上げ、サブサンプリングエラーを最小限に抑えることができるQIAcuity Nanoplate 26Kは、より多くのデータポイントを生成し、遺伝子発現の小さな変化を確実に検出することや、残存病変のモニタリングを可能にします。
- 超希少な変異を0.01%の変異アリル頻度で検出
- dPCR測定は増幅効率の影響を受けないため、全血、尿などの、より未精製なサンプルを測定できる
微生物の検出
感染症の罹患率の増加と集団発生によって、微生物、特に病原体の検出と解析の向上が強く求められるようになりました。公衆衛生と疫学において、病原体の 検出およびマイクロバイオームの解析のどちらにも、迅速性、高感度、正確さを兼ね備えた解析と絶対定量が不可欠です。デジタルPCRは迅速性、高感度、高精度のメソッドであり、病原体やマイクロバイオームの特定、検出、特徴付け、変化の監視に非常に有益です。dPCRの微生物検出が応用できる範囲は、食品中の病原体、薬剤耐性、微生物研究、 抗菌剤耐性遺伝子の調査、ウイルス/細菌の宿主関係と多岐にわたります。
微生物検出におけるナノプレートdPCRを使用するメリット
- 複雑なサンプルや阻害物質が高レベルのサンプルであっても微生物サンプルの正確な絶対定量が可能
- ナノプレート26Kでは、サンプル量を多くロードでき(最大28µl)、感度が向上して、他の商用アッセイの検出限界より少ないターゲットを検出
- オリジナル設計のアッセイのほか、カタログに掲載された700以上のアッセイの中から微生物ターゲット(細菌、ウイルス、毒性因子、AMGなど)に合ったものを最大5アッセイ選択して組み合わせたマルチプレックス化が可能
ウイルス量の定量
ウイルス量テストは、生物学的サンプル中の特定のウイルスの量を測定します。結果は、サンプル1ミリリットルあたりのウイルスRNAのコピー数として報告されます。ウイルス量テストは、急性ウイルス感染診断、治療法の選択ガイド、治療への反応モニタリングに使用されます。
ナノプレートdPCRを毒性遺伝子に使用するメリット
- ナノプレート26Kを使えば少ない量の遺伝子を検出できるため、サンプルあたりのパーティショニング数が増えて、サンプルのロード量を増やすことができます
- 目的の配列のみを特定することで高感度で検出でき、微生物ターゲットとウイルスターゲットのどちらも解析できる能力
- マルチプレックス化により、1つの反応で5つのターゲットを正確かつ効率的に解析
細胞および遺伝子治療
デジタルPCRは、アデノ随伴ウイルスベクターゲノム定量およびレンチウイルスベクターコピー数測定、CAR-T細胞療法の開発と製造など、幅広い遺伝子治療アプリケーションに対応しています。これは、患者の安全を確保しながら、効果的で再現性のある遺伝子治療を開発するために重要です。
ウイルスのタイター測定
QIAcuity dPCRを使うことで、高速、ハイスループットと拡張性を実現しながら、従来のddPCRメソッドと同じレベルの正確さと精度でウイルスベクターを定量できる方法をご紹介します。ウイルスベクターの溶解から残留DNAの定量、ベクターベノムのタイター やゲノムの完全性の判定まで、卓越した正確さ、再現性、迅速性のあるワークフローを紹介します。
ナノプレートdPCRをAVVの定量に使用するメリット
- 当社の専用キットを使用して効率的なカプシド溶解と残留DNAの除去を行えるため、一貫性があり確実な最終のコピー数測定が可能
- プロトコールが1つしかなく、マニュアルのステップ数が最小限で、実作業の時間がわずか10分のため、エラーが減少し、測定までの全作業が簡単
- 最大10の単一ターゲットアッセイを異なる色素の組み合わせでマルチプレックス化できるため、高い精度と柔軟性が可能になります。オプションで、 目的の遺伝子(GOI)ターゲットを含めてアッセイを5プレックスまで拡張可能
- 高機能なQIAcuityソフトウェアによって同時に最大5つのターゲットを使用できるため、ゲノムの完全性の精密な評価が可能
残留宿主細胞DNAの定量
残留宿主細胞DNA(HCD)は、バイオ医薬品製造のプロセス中に持ち込まれ、許容レベルが米国食品医薬品局や世界保健機関などの規制当局によって確立されています。dPCR残留DNA定量キットは、複雑なバイオプロセスにおけるHCDの高精度の定量に最適です。遺伝子治療、治療用タンパク質、同様の生物学的治療薬などの開発中に使用される一般的な宿主細胞には、Human Embryonic Kidney293 cell(HEK293)、Chinse Hamster Ovary cell(CHO)、E. coliがあります。
ナノプレートdPCRを残留宿主細胞DNAの定量に使用するメリット
- 混合済みマスターミックスとポジティブ/インターナルコントロールにより、宿主細胞DNAのセットアップと検出が簡単
- PCR汚染物質や阻害物質が存在していても、大腸菌、CHO、HEK293の残留DNAを低フェムトグラムまで正確に検出
- マルチコピー種特異標的アッセイは、結果がresDNAの断片化レベルによって影響されないことを確保
- dPCRで検証された標準を使用して、定量精度のバリデーションまたはブリッジング試験が可能に
マイコプラズマの検出
マイコプラズマは、バイオ医薬品産業においては細胞株に由来するバイオ製品の汚染菌です。マイコプラズマは、供給源の細胞株(細胞に由来する物質)自体が汚染された結果、または生産の過程で偶発的に持ち込まれた結果として細胞培養に出現します。汚染リスクのガイドライン、バイオ医薬製品の製造におけるマイコプラズマの安全性に関する技術論文が複数ご覧いただけます。
デジタルPCRは細胞培養やその他の細胞培養由来の生物製剤の汚染検出に使用できます。例えば、QIAcuityマイコプラズマ定量キットはRT-dPCRキットで、メソッドの感度を向上させ、rRNAおよびDNAの検出を可能にします。インターナルコントロールによりPCR阻害物質による偽陰性、不適切なRNA抽出、不適切なRT反応が回避できます。プローブベースのアッセイで127種類の異なるマイコプラズマ種を定量、検出することが可能です。
ナノプレートdPCRをマイコプラズマの検出に使用するメリット
- 準拠性:欧州、米国、日本の薬局方に準拠したマイコプラズマ試験のためのNAT(Nucleic Acid Technique)ワークフロー
- 迅速性:時間のかかるマイコプラズマ培養が不要
- 高感度:rRNAの検出において、単一のバクテリア細胞内に複数のコピーが存在するため、DNAのみ使用した場合より高い感度が得られます (10CFU/mL未満を検出)。アッセイはRTステップを省略してもDNAの検出が可能で、高い柔軟性があります。
- 検証済み:ワークフローは包括的な検証レポートの一部として、広範囲にわたって試験されているため、ご自身による検証作業の手間が軽減されます。
- 施設内検証用、または 生体のマイコプラズマを侵入させることのないポジティブコントロールとして使用できる10種類のマイコプラズマ標準CFUキット
遺伝子発現解析
遺伝子発現プロファイリングは、2つ以上のサンプル間で複数の遺伝子の発現レベルを同時に比較します。この解析は、表現型の違う分子基盤を確立し、詳細な研究を行うために遺伝子ターゲットを選択する際に役立ちます。遺伝子発現プロファイリングでは、正常な生物学的状態と疾患における遺伝子発現の違いから、貴重な洞察を得ることができます。
遺伝子発現定量におけるナノプレートdPCRのメリット
- 特に少量テンプレート量でわずかな変化を検出
- 使用するサンプル量に応じて、絶対濃度と存在量を1%未満のサンプルの検証が可能
- ナノプレート26Kでは高精度であり5桁の対数範囲にわたる広いダイナミックレンジを実現します。また、ナノプレート8.5Kでは12µlの反応と「類似」の発現ターゲット(最大4倍の発現変化)の高スループットオプションを使用して、経済的な測定が行えます。
miRNA発現解析
マイクロRNA(miRNA)発現プロファイリングは、2つ以上のサンプル間で複数または単一のmiRNAの発現レベルを同時に比較します。この解析により、がんなどの疾患のバイマーカとしてmiRNAの特定および定量に役立ち、正常な生物学的状態と疾患におけるmiRNA発現の理解において貴重な洞察が得られます。
miRNA発現解析におけるナノプレートdPCRのメリット
- dPCRの高い特異性により、密接な配列関連したmiRNAにおける単一ヌクレオチドの違いを識別
- 特に少量のテンプレート量での微細なmiRNA発現変化の絶対定量が可能
食品検査
マルチプレックスデジタルPCRアッセイは、規制管理、品質保証、GMO試験、食品偽装の検出、食中毒モニタリングなど、幅広い用途で使用されています。これらのアッセイはブタ、ラクダ、ヒツジ、ロバ、ヤギ、ウシ、ニワトリを1回の反応で識別できるなど、動物種を特定し、肉製品の原料を追跡することができます。また、GMO試験の導入遺伝子の定量にも用いられ、研究ではqPCRと比較して、高い感度と再現性が高くなっています。食品偽装を検出するために、dPCRアッセイは、ベジタリアン食品やビーガン食品中の動物由来成分を特定のミトコンドリアおよび葉緑体DNAマーカを標的にして識別できます。さらに、dPCRは、大腸菌、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌などの複数の微生物病原体を同時に検出できるため、効率的に食品の安全と品質が確保できます。
ナノプレートdPCRを食品試験に使用するメリット
- マルチプレックス機能や、dPCRのリファレンスとサンプル間のマトリックスの違いによって引き起こされる増幅効率の影響を最小限に抑えることができるため、複合マトリックスサンプルに理想的です。
- 最大5チャンネル8プレートシステムのマルチプレックス解析により、ハイスループットが可能
- パーティショニングによってバックグラウンドが減少したことに起因する、希少なGMOイベントを高い信頼性で検出
シングルセル解析
細胞集団をバルク解析する従来の方法と比較して、シングルセル解析は単一の細胞レベルでのデータ取得が可能であり、細胞の不均一性、生物学的機能、疾患のプロセスや発症機序の理解を深めることに役立ちます。シングルセル解析に通常使用されるメソッドは、PCR、qPCR、次世代シークエンシング(NGS)を含め、目的のターゲットを検出する上で感度が不足している場合があります。
デジタルPCRは、費用対効果が良く、直感的で正確なdPCRプラットフォームで、ハイスループット、優れた検出感度と精度が得られる特性を有していることから、近年シングルセル解析に使用する方法として注目を集めています。
ナノプレートdPCRをシングルセル解析に使用するメリット
- 精度が高く、物理的なパーティショニングがドロップレットより安定しています
- プローブベースの検出は、最小限の最適化で単一のdPCR反応で最大5つターゲットをマルチプレックス解析を行えます。
- 正確な結果により、少量のターゲットやマルチコピーのターゲットであっても単一の細胞レベルで解析することが可能になります。
ゲノム編集検出(CRISPR-Cas9)
ジンクフィンガー(ZFN)、転写活性化因子様エフェクター(TALEN)、 クラスター化した規則的間隔の短い回文配列リピート(CRISPR)などのヌクレアーゼは、あらゆるの細胞のゲノムを編集するために使用されます。このような ヌクレアーゼは、部位特異的なDNA二本鎖切断(DSB)を生成し、不正確でエラーが発生しやすい 非相同末端結合(NHEJ)(ドナーテンプレート/正確な点突然変異)または、 標的変異誘発につながる経路である相同性誘導修復(相同組換え:HDR)(欠失/インデル/挿入)によって修復されます。 その結果、不均一なインデルエラーとさまざまな対立遺伝子編集頻度を有する細胞の混合集団が発生します。次に、目的の 遺伝子座のゲノム編集頻度を測定します。クローン細胞株は単一細胞を分離し、編集部位をアッセイにて解析することで ゲノム編集イベントを検証します。
ゲノム編集検出をナノプレートdPCRで評価するメリット(CRISPR-Cas9)
- より高い感度により、0.5%の頻度で存在する編集イベントの検出が可能
- わずか5ngのトータルgDNAから編集イベントを絶対定量
- クローン集団におけるホモ接合性編集とヘテロ接合性編集を区別して検出が可能
NGSライブラリー定量
次世代シークエンシング用のライブラリ定量は、フローセルを最大効率で使用するために不可欠なステップです。不正確なライブラリの定量に続いて、その後にNGSライブラリのロード量が過度であったり不足していたりすると、得られるデータと品質が損われます。デジタルPCRを使用してNGSライブラリプールの絶対濃度を測定することは、最適な収量を得て、サンプルあたりのコストを削減するのに非常に役立ちます。
ナノプレートデジタルPCRをNGSライブラリの定量に使用するメリット
- ルーチンワークに適した、 増幅バイアスも標準バイアスもない、 増幅可能なライブラリの絶対定量が実施でき、 結果が2時間で得られる
- すべてのIlluminaライブラリタイプを 1つのアッセイでカバーしたライブラリプーリングにおいて 高い再現性と均一性に優れています
タンパク質定量とタンパク質間相互作用
Actome’のタンパク質間相互作用結合(PICO)テクノロジーは、QIAcuityデジタルPCRシステムを利用して、単一タンパク質およびタンパク質間相互作用の検出、定量するための非常に汎用性が高く、感度の高いアプローチを提供します。PICOテクノロジーは、複雑なタンパク質状態をDNAバーコード技術に変換し、dPCRを使用して増幅および検出を行います。これはタンパク質結合を指標にした細胞経路の解析、タンパク質バイオマーカーの探索、医薬品研究のための画期的なアッセイ開発、マルチオミクス解析において特に役立ちます。
ナノプレートタイプのdPCRをタンパク質の検出に使用するメリット
- dPCRを使用してタンパク質を定量できる市場で唯一の技術
- 単一細胞レベルでタンパク質、タンパク質間相互作用、翻訳後修飾を検出