therascreen GIST RapidScreen Pyro Kit

Le kit therascreen GIST RapidScreen Pyro Kit est un kit de détection moléculaire destiné à la détection quantitative rapide des mutations dans les gènes humains KIT et PDGFRA. Ce kit inclut les enzymes, les amorces et les réactifs pour l’amplification des gènes, ainsi que les tampons, amorces et réactifs pour la détection et la quantification des mutations en temps réel via la technologie de pyroséquençage (Pyrosequencing) sur le système PyroMark Q24. (4)

La limite du blanc (LoB) et la limite de détection (LoD) ont été déterminées pour un certain nombre de mutations à l’aide de mélanges de plasmides (voir le tableau « LoB et LoD déterminées pour des mutations spécifiques »). Les LoB et LoD ont été déterminées conformément aux recommandations du protocole EP17A du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) « Protocol for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline ». Les erreurs alpha et bêta (respectivement faux positif et faux négatif) ont été définies à 5 %. La LoD de certaines délétions rares au niveau de l’exon 18 du gène PDGFRA a été déterminée en ajoutant 3 écarts-types de mesures de blanc à la valeur de LoB. Les valeurs de la LoD ont été définies au moins à 3 unités de % au-dessus de la valeur de LoB. Les valeurs de la LoB représentent la fréquence mesurée obtenue avec un échantillon de type sauvage. Les valeurs de la LoD représentent le signal le plus bas (fréquence mesurée) qui peut être considéré comme positif pour la mutation correspondante. (4) Voir le kit du manuel pour obtenir davantage de données sur les performances du kit.

Le kit therascreen GIST RapidScreen Pyro est utilisé pour les mesures quantitatives de mutations de l’exon 9 du gène KIT et de l’exon 18 du gène PDGFRA. La détection de mutations au niveau de l’exon 9 du gène KIT permet de définir l’utilisation d’une dose d’imatinib appropriée. La détection de mutations au niveau de l’exon 18 du gène PDGFRA contribue à exclure les génotypes moins sensibles ou résistants (1–3). Le kit contient 2 tests : le premier pour la détection des mutations au niveau de l’exon 9 du gène KIT et le second pour la détection des mutations au niveau de l’exon 18 du gène PDGFRA. Les deux régions sont amplifiées séparément par PCR et séquencées dans la région définie. Les séquences entourant les positions définies servent de valeurs maximales de normalisation et de référence pour l’évaluation quantitative et qualitative de l’analyse. Le produit contient un mélange d’amorce PCR et une amorce de séquence pour chaque test. Les amorces sont livrées en solution. Chaque tube contient 32 µl de chaque amorce ou mélange d’amorce.

Références

1. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group (2012) Gastrointestinal stromal tumors: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann. Oncol. 23 (Supplement 7), vii49.
2. Gastrointestinal Stromal Tumor Meta-Analysis Group (MetaGIST) (2010) Comparison of two doses of imatinib for the treatment of unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors: A meta-analysis of 1,640 patients. J. Clin. Oncol. 28, 1247.
3. Joensuu, H. (2006) Gastrointestinal stromal tumor (GIST). Ann. Oncol. 17 (Supplement 10), x280.
4. Manuel du kit therascreen GIST RapidScreen Pyro. Version 1, révision 1, Mai 2013.

Après la PCR à l’aide des amorces ciblant l’exon 9 du gène KIT et l’exon 18 du gène PDGFRA, les amplicons sont immobilisés sur des billes de sépharose recouvertes de streptavidine (Streptavidin Sepharose High Performance). L’ADN simple brin est préparé et les amorces de séquence correspondantes s’hybrident avec l’ADN. Les échantillons sont ensuite analysés sur PyroMark Q24 à l’aide de fichiers de configuration du test et d’un fichier d’analyse. Il est recommandé d’utiliser le GIST RapidScreen Plug-in Report pour analyser le test. Il est possible d’obtenir le GIST RapidScreen Plug-in Report par e-mail en écrivant à l’adresse pyro.plugin@qiagen.com. Toutefois, le test peut également être analysé à l’aide de l’outil d’analyse intégré au système PyroMark Q24. La fonction « Sequence to Analyze » (séquence à analyser) peut être ajustée afin de détecter les mutations rares après l’analyse. (4)

Le kit therascreen GIST RapidScreen Pyro Kit est un test in vitro de détection fondé sur les séquences d’acide nucléique et la technologie du Pyrosequencing ou pyroséquençage, pour la détection quantitative des mutations au niveau de l’exon 9 du gène KIT humain et de l’exon 18 du gène PDGFRA humain dans l’ADN génomique provenant d’échantillons de tissu humain. Le kit therascreen GIST RapidScreen Pyro vise à fournir aux cliniciens des informations pour les aider dans l’orientation du traitement de patients atteints de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) les plus susceptibles de bénéficier de médicaments agissant sur les voies de signalisation, tels que l’imatinib. Utilisation prévue pour le diagnostic in vitro. Ce produit n’est pas destiné à être utilisé avec des échantillons de tissus pulmonaires. (4)