QuantiNova RT-PCR Kits

• Procédure unique de hot start en deux phases pour une configuration à température ambiante
• Contrôle visuel du pipetage pour en réduire les erreurs
• Contrôle interne pour la vérification positive en cours de processus de la réussite de la RT-PCR
• Quantification précise sur plusieurs logs de matrice
• Détection sensible d’un maximum de 5 cibles dans un seul tube

Les QuantiNova RT-PCR Kits (kits RT-PCR en temps réel) permettent une quantification sensible des cibles ARN par PCR en temps réel en une étape à l’aide du SYBR Green I ou des sondes spécifiques à une séquence. Une combinaison de diverses fonctionnalités de sécurité intégrées permet d’éliminer les variables et d’éviter les artefacts, pour garantir un profilage fiable de l’expression des gènes. La combinaison d’un système unique de hot start en deux phases et d’un tampon PCR dans le mélange principal prêt à l’emploi permet une configuration à température ambiante et garantit une qRT-PCR très sensible sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Le QuantiNova Internal Control RNA (en option) peut être utilisé pour tester la réussite de la transcription inverse et de l’amplification. Il est censé révéler tout dysfonctionnement de la réaction chimique ou de l’appareil, les erreurs de préparation du dosage et la présence d’inhibiteurs. De surcroît, il est possible d’utiliser le contrôle visuel du pipetage pour enregistrer le pipetage correct. L’étape de réduction de l’ADNg intégrée dans la procédure QuantiNova Probe RT-PCR empêche la surquantification des transcriptions causée par le transfert d’ADN génomique.

Le QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit permet une quantification rapide et fiable d’un maximum de 5 cibles ARN dans un seul tube par real-time PCR multiplex. Notre technologie Q-bond et un mélange principal optimisé favorisent une PCR en temps réel multiplex ultrarapide en 1 heure. La combinaison d’une procédure unique de hot start en deux phases avec notre système de tampon PCR multiplex garantit une qRT-PCR très sensible sur n’importe quel thermocycleur en temps réel, sans qu’il soit nécessaire de l’optimiser, et permet une configuration automatisée de la réaction à température ambiante. Le kit fournit également des protocoles pour l’extraction d’ARN et l’amplification directe à partir de cellules cultivées, même pour une seule cellule. Vous pouvez utiliser le QuantiNova Internal Control RNA en option pour enregistrer la réussite de la transcription inverse et de l’amplification, et le contrôle visuel du pipetage afin d’enregistrer le pipetage correct.

Indicateur visuel intégré pour une configuration précise de la réaction

Le mélange principal fourni avec les QuantiNova RT-PCR Kits contient un colorant bleu inerte qui n’interfère pas avec la real-time PCR, mais augmente la visibilité dans le tube ou le puits. Le QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer contient un colorant jaune inerte. Lorsque l’acide nucléique matrice est dilué dans le QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer et ajouté au mélange principal, la couleur de la solution passe du bleu au vert (voir figure «  Configuration précise de la réaction indiquée par le contrôle de pipetage intégré »), ce qui fournit une indication visuelle que chaque réaction a été réglée correctement.

QuantiNova SYBR Green et QuantiNova Probe RT-PCR Kits

Les QuantiNova SYBR Green et QuantiNova Probe RT-PCR Kits utilisent une procédure de hot start en deux phases (voir figure «  Principe du nouveau mécanisme hot start en deux phases QuantiNova »). Cela comprend l’activation à chaud de la transcriptase inverse HotStaRT-Script à 50 °C (kits SYBR Green et multiplex) ou 45 °C (kit de sonde) et de la polymérase PCR à 95 °C. À basse température, le script HotStaRT forme un complexe avec une molécule RT-Blocker, ce qui entraîne son inactivation. À 50 °C (kits SYBR Green et multiplex) ou 45 °C (kit de sonde), le complexe se dissocie et l’enzyme HotStaRT-Script active est libérée. La QuantiNova DNA Polymerase est conservée dans un état inactif par l’anticorps QuantiNova et un nouvel additif, le protecteur QuantiNova qui stabilise le complexe. Cela permet d’améliorer la rigueur de la procédure de hot start et d’éviter l’extension d’amorces et des dimères d’amorces non spécifiquement renaturées. Dans les 2 minutes (kits SYBR Green et multiplex) ou 5 minutes (kit de sonde) qui suivent l’augmentation de la température à 95 °C, l’anticorps QuantiNova et le protecteur QuantiNova sont dénaturés et l’ADN polymérase QuantiNova est activée, permettant l’amplification par PCR. Ce hot start unique en deux phases permet à la configuration de la réaction de rester stable pendant au moins 2 heures à température ambiante (voir figure «  Configuration pratique de la réaction à température ambiante sans compromettre les performances ») ; cela empêche la création d’artefacts et facilite également la réalisation d’une configuration automatisée de la réaction.

La QuantiNova DNA Polymerase et la composition unique du tampon RT-PCR permettent une quantification sensible des cibles d’ARN à faible taux de copie, ainsi qu’une quantification précise sur une large plage linéaire sur n’importe quel thermocycleur courant (voir figure «  Quantification précise avec des quantités d’entrée très élevées ou très faibles »).

L’étape de réduction de l’ADNg dans les procédures de QuantiNova Probe RT-PCR minimise les erreurs de quantification causées par le transfert d’ADN génomique. La réduction de l’ADN génomique est essentielle pour obtenir des résultats précis en matière d’expression génique et élimine la nécessité de concevoir des amorces ou des sondes propres à l’ARN. Avec la réduction intégrée de l’ADNg (voir figure «  Fiabilité accrue des résultats d’expression génique grâce à la réduction de l’ADNg »), on enregistre un gain de temps et une réduction des coûts, car il n’est pas nécessaire de procéder à une digestion DNase séparée pendant ou après la purification des échantillons d’ARN.

Le nouveau contrôle interne est une transcription définie (molécule d’ARN) qui peut simplement être ajoutée à vos échantillons et transcrite en ADNc. Il est censé révéler tout dysfonctionnement de la réaction chimique ou de l’appareil, les erreurs de préparation du dosage ou la présence d’inhibiteurs. Dans la mesure où le contrôle interne se comporte de manière comparable aux transcriptions réelles (voir figure «  Enregistrement fiable de l’inhibition de la RT-PCR »), il est possible de l’utiliser pour confirmer la réussite de la transcription inverse et de l’amplification. La capacité duplex permet également d’inclure le contrôle interne ou un gène de référence pour une comparaison directe avec le gène cible.

La QuantiNova DNA Polymerase et la composition unique du tampon RT-PCR permettent une quantification sensible des cibles d’ARN à faible taux de copie, ainsi qu’une quantification précise sur une large plage linéaire sur n’importe quel thermocycleur courant.

QuantiNova Multiplex RT-PCR Kits

Le mélange principal spécialisé fourni avec le QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit permet une configuration facile des réactions multiplex et garantit que les résultats sont comparables à ceux de la RT-PCR singleplex. Le mélange principal 4x hautement concentré peut contenir jusqu’à 800 ng de matrice et offre une sensibilité exceptionnelle, même avec des réactions 5-plex.

Le kit peut clairement distinguer de petites différences dans la quantité de matrice et fournit une quantification précise de cibles dont l’abondance est très variable (voir figure «  Détection multiplex très sensible de cibles présentant une abondance variable »). De plus, un protocole simple pour l’amplification directe à partir de cellules cultivées est fourni, permettant l’analyse de l’ARN même à partir d’une seule cellule (voir figure «  Analyse multiplex de l’expression génique dans des cellules uniques »). La procédure unique de hot start en deux phases (voir figure «  Principe du nouveau mécanisme hot start en deux phases QuantiNova ») garantit une spécificité exceptionnelle et permet une configuration de la réaction à température ambiante, ce qui convient parfaitement aux procédures automatisées. Le tampon PCR spécialement développé contient l’additif Q-Bond, lequel réduit considérablement les temps de renaturation et d’extension, ce qui permet une qRT-PCR multiplex en une heure environ. L’ajout d’un contrôle visuel du pipetage augmente la sécurité en cours de processus tout en minimisant les erreurs humaines (voir figure «  Configuration précise de la réaction indiquée par le contrôle de pipetage intégré »). L’ARN de contrôle interne optionnel, qui peut être codétecté avec les cibles, supprime les variations causées par les inhibiteurs ou d’autres facteurs, ce qui permet d’enregistrer la précision et la reproductibilité. Dans l’ensemble, notre procédure de qRT-PCR multiplex ultrarapide et contrôlée en cours de processus augmente l’efficacité en générant plus d’informations à partir d’un matériel d’échantillonnage limité.

Les QuantiNova RT-PCR Kits contiennent des mélanges principaux optimisés et prêts à l’emploi pour une quantification en temps réel hautement spécifique et sensible des cibles ARN à l’aide du colorant fluorescent SYBR Green I ou de sondes spécifiques de la séquence. Le QuantiNova Probe RT-PCR Kit est conçu pour être utilisé avec différents types de sondes spécifiques de séquences, y compris les sondes d’hydrolyse (par exemple, TaqMan et d’autres sondes à double marquage) et les amorces Scorpions. Les kits sont fournis avec un tampon PCR unique qui contient une combinaison équilibrée d’ions K⁺ et NH₄⁺, ce qui favorise la renaturation spécifique des amorces, permettant une spécificité et une sensibilité élevées. De plus, le HotStaRT-Script permet la synthèse d’ADNc à partir d’un grand nombre de quantités de matrice d’ARN, tandis que l’ADN polymérase QuantiNova fournit une procédure rigoureuse de hot start, empêchant la formation de produits non spécifiques. La procédure unique de hot start en deux phases permet à la configuration de la réaction de rester stable jusqu’à deux heures à température ambiante, prenant en charge la configuration automatisée de la réaction.

Le contrôle visuel intégré permet de vérifier si la matrice a été ajoutée à la réaction et évite ainsi les erreurs de pipetage lors de la configuration de la réaction.

La détection des variations dans la synthèse de l’ADNc vous permet de vérifier la reproductibilité de vos résultats. Le nouveau contrôle interne est une transcription définie (molécule d’ARN) qui peut être ajoutée à vos échantillons et transcrite en ADNc. Il est censé révéler tout dysfonctionnement de la réaction chimique ou de l’appareil, les erreurs de préparation du dosage et la présence d’inhibiteurs.

Pour obtenir des résultats précis dans les dosages d’expression génique par real-time PCR, il importe que seul l’ADNc soit amplifié et détecté. Les interférences dues à l’ADN génomique sont évitées grâce à l’étape de réduction de l’ADNg dans les procédures de QuantiNova Probe RT-PCR (voir figure «  Fiabilité accrue des résultats d’expression génique grâce à la réduction de l’ADNg »). Cela permet d’enregistrer des gains de temps et de réduire les coûts, car il n’est pas nécessaire de procéder à une digestion DNase séparée pendant ou après la purification des échantillons d’ARN. Il n’est pas non plus nécessaire de concevoir des amorces ou des sondes spécifiques à l’ARN.
Le QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit fournit des résultats très sensibles et rapides sur une large plage dynamique, à la fois sur des thermocycleurs standards et rapides, sans optimisation. Le tampon PCR spécialement développé contient l’additif Q-Bond, qui réduit considérablement les temps de renaturation et d’extension. L’amplification des gènes de référence et des gènes cibles dans la même réaction augmente la fiabilité en minimisant les variations d’un puits à l’autre et les erreurs de manipulation. De plus, un ARN de contrôle interne est fourni et peut être détecté simultanément pour enregistrer la réussite de la transcription inverse et de la qPCR.

Les QuantiNova SYBR Green et Probe RT-PCR Kits permettent de s’affranchir de l’optimisation des conditions de réaction, qui peut s’avérer fastidieuse et chronophage. Il suffit d’ajouter les amorces, la matrice d’ARN et le mélange RT au mélange RT-PCR ou au mélange principal prêt à l’emploi et de démarrer la réaction. Suivez le protocole du manuel du QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit ou du QuantiNova Probe RT-PCR pour obtenir des résultats rapides et fiables sur n’importe quel thermocycleur en temps réel.

Le QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit contient un mélange principal 4x prêt à l’emploi, ce qui élimine la nécessité d’optimiser les conditions de réaction et de thermocyclage. Il suffit d’ajouter le mélange RT, jusqu’à 800 ng d’ARN matrice et les ensembles amorce-sonde au mélange principal et de suivre le protocole du manuel pour obtenir des résultats rapides et fiables sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Le colorant de référence ROX est également fourni dans un tube séparé, ce qui permet d’ajuster la concentration en fonction de votre appareil. Le kit propose également un protocole simple et rapide pour l’amplification directe à partir de cellules cultivées. La quantité d’entrée recommandée va de 2000 cellules à une seule cellule, par exemple, séparée par dilution en série ou à l’aide de l’appareil QIAscout. L’ARN de contrôle interne QuantiNova (QN IC RNA) est un contrôle d’amplification interne qui peut être utilisé en option pour tester la réussite de la transcription inverse et de l’amplification. Il est détecté en tant que contrôle interne de 200 pb dans le canal jaune du Rotor‑Gene Q ou dans le canal du colorant VIC/HEX sur d’autres appareils de real-time PCR lors de l’utilisation du QuantiNova IC Probe Assay. Il peut également être détecté dans le canal rouge du Rotor‑Gene Q ou dans le canal du colorant Cy5 sur d’autres appareils de real-time PCR lors de l’utilisation du QuantiNova IC Probe Assay Red 650.

Pour une procédure simplifiée, nous recommandons de combiner les kits QuantiNova avec nos dosages ou panels de real-time PCR QuantiNova préconçus. Ils permettent de quantifier avec précision les ARNm ou les longues transcriptions d’ARN non codants, quelle que soit leur abondance. Choisissez parmi un grand nombre d’ensembles d’amorces prédéfinis pour l’homme, la souris et le rat, ou personnalisez vos propres dosages et panels à l’aide de nos outils de conception avancés.
 
Nos QuantiNova LNA PCR et QuantiNova LNA Probe PCR Assays utilisent la technologie LNA pour une sensibilité accrue, ce qui permet d’obtenir des profils d’expression génique non biaisés et d’accélérer les connaissances scientifiques.

Pour une détection basée sur le SYBR Green, commandez le QuantiNova IC SYBR Green Assay (disponible sous le nom HS_QIC_2467742 QuantiNova LNA PCR Reference Assay et ID GeneGlobe : SBH1218551) par le biais de notre plateforme GeneGlobe.

Remarque : Le QuantiNova IC SYBR Green Assay était auparavant disponible sous le nom de QuantiTect Primer Assay for SYBR-based detection of IC RNA (n° de réf. QT02589307).

Les RT-PCR QuantiNova SYBR Green et Probe Kitspeuvent être utilisés pour l’analyse de l’expression génique des cibles ARN sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Il s’agit notamment du Rotor‑Gene Q et des appareils d’Applied Biosystems, de Bio-Rad, de Cepheid, d’Eppendorf, de Roche et d’Agilent.

Le QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit peut être utilisé pour l’analyse multiplex de l’expression génique des cibles ARN sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Pour profiter pleinement du multiplexage, nous recommandons d’utiliser un appareil qui offre une capacité allant jusqu’à 5-plex, tel que le Rotor‑Gene Q.