QuantiNova Pathogen +IC Kit

• Contrôles internes préoptimisés sans frais supplémentaires
• (RT)-PCR 4-plex pour la détection des cibles pathogènes et contrôle interne
• Procédure unique de hot start en deux phases pour une configuration pratique à température ambiante
• RT stable incluse dans le mélange principal, offrant un protocole facile à utiliser
• Contrôle visuel du pipetage pour minimiser les erreurs

Le QuantiNova Pathogen +IC Kit est conçu pour la détection sensible et rapide par real-time PCR (RT-) d’acides nucléiques de pathogènes à l’aide de sondes spécifiques à une séquence. Le kit contient des réactifs pour la détection 4-plex en temps réel de cibles pathogènes définies par l’utilisateur (par exemple, virus, bactéries, champignons, etc.) plus le contrôle interne QuantiNova (IC) ARN ou ADN. Les IC et le dosage sont inclus pour être utilisés comme contrôles d’extraction ou d’amplification, ce qui permet une interprétation correcte des résultats de détection négatifs. En outre, le kit prêt à l’emploi ultrarapide offre une configuration pratique de la réaction à température ambiante pour une procédure rationalisée et automatisée, ainsi qu’un contrôle visuel du pipetage pour améliorer les normes de manipulation et de sécurité. Pour des raisons de commodité, le mélange principal peut être conservé entre 2 et 8 °C.

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Le QuantiNova Pathogen +IC Kit permet la détection simultanée des cibles ARN ou ADN virales et du contrôle interne (IC) QuantiNova sur une large plage linéaire sans perte de sensibilité lors du multiplexage. Le protocole a été développé pour effectuer des expériences de thermocyclage ultrarapide avec une grande fiabilité sur la plupart des thermocycleurs. L’amplification combinée des cibles pathogènes et de l’ARN ou de l’ADN de l’IC accroît la sécurité en cours de processus en garantissant l’interprétation correcte des résultats négatifs. L’IC inclus peut être utilisé pour enregistrer le processus de purification et/ou d’amplification de l’acide nucléique, tandis que le contrôle visuel du pipetage permet de vérifier visuellement le pipetage manuel ou robotisé (voir figure  Configuration précise de la réaction indiquée par le contrôle de pipetage intégré). Grâce à la procédure unique de hot start en deux phases, il est possible d’effectuer une configuration manuelle ou automatisée de la réaction à température ambiante sans compromettre les performances (voir figure  Principe du nouveau mécanisme hot start en deux phases QuantiNova). Le QuantiNova Pathogen +IC Kit est robuste même en présence d’inhibiteurs et permet l’utilisation d’amorces/sondes dégénérées. Le kit offre une qPCR multiplex ultrarapide et contrôlée en cours de processus, ce qui augmente l’efficacité et la fiabilité de la procédure.

Pour permettre une plus grande sécurité en cours de processus grâce à l’interprétation correcte des résultats négatifs, chaque QuantiNova Pathogen +IC Kit contient des réactifs pour la détection multiplex en temps réel de cibles pathogènes définies par l’utilisateur avec des contrôles internes. L’amplification des gènes cibles et des gènes de contrôle dans la même réaction augmente la fiabilité en minimisant les erreurs de manipulation. Il est possible d’utiliser l’IC fourni pour tester la réussite de l’amplification (par exemple, exclusion des inhibiteurs de la PCR) ou de l’ajouter à l’échantillon avant la purification de l’acide nucléique pour contrôler à la fois l’efficacité du processus de purification et l’amplification de la PCR ou de la RT-PCR. La real-time PCR et la RT-PCR en une étape peuvent être réalisées simultanément à l’aide du même protocole. Le kit utilise également une procédure de hot start en deux phases (voir figure  Principe du nouveau mécanisme hot start en deux phases QuantiNova). Cela comprend l’activation par la chaleur de la transcriptase inverse HotStaRT-Script à 50 °C et de la polymérase PCR à 95 °C. À basse température, le script HotStaRT forme un complexe avec une molécule RT-Blocker, ce qui entraîne son inactivation. À 50 °C, le complexe se dissocie et l’enzyme HotStaRT-Script active est libérée. La QuantiNova DNA Polymerase est conservée dans un état inactif par l’anticorps QuantiNova et un nouvel additif, le protecteur QuantiNova qui stabilise le complexe. Cela permet d’améliorer la rigueur de la procédure de hot start et d’éviter l’extension d’amorces et des dimères d’amorces non spécifiquement renaturées. Dans les 2 minutes qui suivent l’augmentation de la température à 95 °C, l’anticorps QuantiNova et le protecteur QuantiNova sont dénaturés et l’ADN polymérase QuantiNova est activée, permettant l’amplification par PCR. Ce hot start unique en deux phases permet à la configuration de la réaction de rester stable pendant au moins 1 heure à température ambiante, ce qui évite la création d’artefacts et facilite également la configuration automatisée de la réaction.
De manière complémentaire, le mélange principal fourni avec le kit contient un colorant bleu inerte qui n’interfère pas avec la transcription inverse ou la real-time PCR, mais qui augmente la visibilité dans le tube ou le puits. Le QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer contient un colorant jaune inerte. Lorsque l’acide nucléique matrice, dilué avec le tampon de dilution de matrice jaune QuantiNova, est ajouté au mélange principal, la couleur de la solution se modifie du bleu au vert, fournissant une indication visuelle du pipetage correct et de la configuration de la réaction (voir figure  Configuration précise de la réaction indiquée par le contrôle de pipetage intégré). Le mélange principal comprend une combinaison équilibrée d’ions K⁺ et NH₄⁺ ainsi que le Factor MP synthétique unique qui, ensemble, favorisent une renaturation stable et efficace des amorces et des sondes sur la matrice d’acide nucléique, ce qui permet une grande efficacité de la PCR, même dans les réactions multiplex (voir figure  Le tampon PCR multiplex unique favorise une renaturation stable et efficace). Le tampon PCR spécialement conçu contient du Q-Bond, qui réduit considérablement les temps de dénaturation, de renaturation et d’extension (voir figure  Mécanisme de thermocyclage rapide pendant la renaturation). Le tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect, fourni avec le kit, stabilise les étalons d’ARN et d’ADN pendant la dilution et la configuration de la réaction et empêche la perte d’acides nucléiques sur les surfaces en plastique, telles que les tubes ou les pointes de pipette. Le mélange principal peut être conservé entre 2 et 8 °C jusqu’à 12 mois, et la réaction est stable à température ambiante pendant au moins une heure, ce qui est pratique pour les procédures automatisées.