PAXgene Blood RNA Kit (IVD)

• Conforme à la directive européenne IVD 98/79/CE
• Système intégré pour le prélèvement, la stabilisation et la purification (1)
• Stabilisation de l’ARN entre 18 et 25 °C pour une durée maximale de 3 jours (1)
• Stabilisation à -20 ou -70 °C pendant au moins 60 mois (1)
• Traitement standardisé des échantillons avant l’analyse (1)

Le système PAXgene Blood RNA se compose des tubes PAXgene Blood RNA (disponibles auprès de BD, n° de réf. 762165) pour le prélèvement, la stabilisation et le transport de sang, et du kit PAXgene Blood RNA pour l’isolement et la purification de l’ARN à partir d’une membrane de silice dans des colonnes de centrifugation. La purification peut être effectuée manuellement, par microcentrifugeuse ou de façon automatisée sur le QIAcube. Les tubes et kits conformes au marquage CE-IVD offrent des spécifications de performances exactes, assurant une purification très fiable de l’ARN. (1)

Les tubes PAXgene Blood RNA sont destinés au prélèvement de sang total et à la stabilisation d’ARN intracellulaire pour une durée maximale de 3 jours à une température entre 18 et 25 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : IL1B ») ou jusqu’à 5 jours entre 2 et 8 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : IL1B »). Les données actuellement disponibles indiquent une stabilisation de l’ARN cellulaire pendant au moins 60 mois à -20 °C ou -70 °C.

L’ARN total purifié à l’aide du système PAXgene Blood RNA est très pur, avec des valeurs A₂₆₀/A₂₈₀ comprises entre 1,8 et 2,2 et un ADN génomique ≤ 1,0 % (m/m). Au moins 95 % des échantillons ne présentent aucune inhibition à la RT-PCR lorsque 30 % maximum de l’éluat est utilisé.
La durée moyenne de préparation des échantillons (à partir des données de 12 préparations d’échantillons) est d’environ 90 minutes, dont seulement 40 minutes de manipulation. Le rendement d’ARN prélevé sur 2,5 ml de sang total humain est ≥ 3 µg pour ≥ 95 % des échantillons traités. Les rendements dépendent fortement du donneur. Les rendements individuels peuvent donc varier. Pour les donneurs individuels, le système PAXgene Blood RNA offre des rendements hautement reproductibles et répétables (voir figures « Reproductibilité et répétabilité de la purification d’ARN » et « Répétabilité et reproductibilité du rendement de l’ARN ») et une RT-PCR reproductible et répétable (voir figures « Reproductibilité entre utilisateurs » et « Reproductibilité entre lots de kits », et le tableau correspondant), ce qui le rend très robuste pour les tests de diagnostic clinique.

Le rendement d’ARN prélevé sur 2,5 ml de sang total humain est ≥ 3 µg pour ≥ 95 % des échantillons traités. La figure « Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique » indique les rendements d’ARN sur un total de 288 échantillons préparés en protocole automatisé avec 3 lots de kits et 3 opérateurs. Étant donné que des échantillons sanguins en pool ont été utilisés à la place des tubes individuels PAXgene Blood RNA pour ces études, les résultats ne reflètent pas le rendement d’ARN attendu à partir d’échantillons individuels de prélèvement sanguin. Les rendements dépendent fortement du donneur. Les rendements individuels peuvent donc varier.

Au moins 95 % des échantillons ne présentent aucune inhibition à la RT-PCR lorsque 30 % maximum de l’éluat est utilisé. En protocole automatisé, la contamination croisée entre les échantillons est indétectable, comme le mesure la RT-PCR quantitative en temps réel pour les séquences de bêta-globine et les transcripts FOS dans les échantillons négatifs en ARN (eau) couplés à des échantillons positifs en ARN (sang total humain) lors de la même analyse.

L’ARN purifié avec le système PAXgene Blood RNA et le protocole automatisé est très pur, comme l’indique l’absence d’inhibition à la RT-PCR (voir ci-dessus) et les valeurs A₂₆₀/A₂₈₀ comprises entre 1,8 et 2,2. L’ADN génomique est présent à ≤ 1 % (m/m) dans ≥ 95 % des échantillons, comme le mesure la PCR quantitative en temps réel d’une séquence du gène de la bêta-actine. La figure « Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique » indique les valeurs A₂₆₀/A₂₈₀ et l’ADN génomique relatif d’un total de 288 échantillons préparés en protocole automatisé avec 3 lots de kits et 3 opérateurs. 

Le protocole automatisé de la purification d’ARN au moyen du système PAXgene Blood RNA offre des résultats de RT-PCR hautement reproductibles et répétables, comme indiqué à la figure « Reproductibilité entre les protocoles automatisé et manuel », ce qui le rend très robuste pour les tests de diagnostic clinique.

Le kit PAXgene Blood RNA est destiné à la purification de l’ARN total de 2,5 ml de sang total humain prélevé dans un tube PAXgene Blood RNA. La procédure est simple et peut être réalisée de façon manuelle ou automatique (voir schémas « Procédure manuelle PAXgene Blood RNA » et « Procédure automatisée PAXgene Blood RNA »). 

Les tubes PAXgene Blood RNA présentent une composition de réactifs exclusive fondée sur une technique brevetée de stabilisation de l’ARN (brevets américains 6,602,718 et 6,617,170). Cette composition de réactifs protège les molécules d’ARN de la dégradation par les RNases et minimise les modifications ex vivo de l’expression du gène. Les tubes PAXgene Blood RNA sont destinés au prélèvement de sang total et à la stabilisation d’ARN intracellulaire pour une durée maximale de 3 jours à une température comprise entre 18 et 25 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : IL1B ») ou jusqu’à 5 jours entre 2 et 8 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : IL1B »). Les données actuellement disponibles indiquent une stabilisation de l’ARN cellulaire pendant au moins 60 mois à -20 °C ou -70 °C.

La procédure PAXgene Blood RNA est simple et peut être réalisée de façon manuelle ou automatique (voir schémas « Procédure manuelle PAXgene Blood RNA » et « Procédure automatisée PAXgene Blood RNA »).

Procédure manuelle PAXgene Blood RNA

Le culot remis en suspension est incubé dans des tampons optimisés avec de la protéinase K pour entraîner la digestion des protéines. En outre, une centrifugation est effectuée par moyen de la colonne de centrifugation PAXgene Shredder afin d’homogénéiser le lysat de cellules et d’éliminer les débris cellulaires résiduels. Le surnageant de la fraction intermédiaire est transféré dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. De l’éthanol est ajouté afin d’ajuster les conditions de liaison et le lysat est appliqué sur une colonne de centrifugation PAXgene RNA. Lors d’une brève centrifugation, l’ARN est lié de manière sélective à la membrane de silice PAXgene et les contaminants passent à travers. Les contaminants restants sont éliminés par plusieurs étapes de lavage efficaces. Entre la première et la deuxième étape de lavage, la membrane est traitée avec de la DNase I afin de supprimer les traces d’ADN lié. Après les étapes de lavage, l’ARN est élué dans un tampon d’élution et subit une dénaturation thermique.

Procédure automatisée PAXgene Blood RNA

La préparation des échantillons, automatisée sur le QIAcube, suit les mêmes étapes que la procédure manuelle et vous permet de continuer à utiliser le kit PAXgene Blood RNA pour la purification d’ARN de haute qualité. 

Le protocole automatisé de purification d’ARN consiste en 2 parties (ou protocoles) : « PAXgene Blood RNA Part A » et « PAXgene Blood RNA Part B » avec une brève intervention manuelle entre les 2 parties.

Le culot d’acide nucléique centrifugé, lavé et remis en suspension est transféré du tube PAXgene Blood RNA aux tubes de traitement, lesquels sont placés dans l’agitateur thermique sur la table de travail QIAcube. L’opérateur sélectionne et lance le protocole « PAXgene Blood RNA Part A » à partir du menu. Le QIAcube effectue les étapes du protocole jusqu’à l’élution de l’ARN dans le tampon d’élution. L’opérateur transfère les tubes de microcentrifugeuse, qui contiennent l’ARN purifié, dans l’agitateur thermique du QIAcube. Il lance alors le protocole « PAXgene Blood RNA Part B » à partir du menu, et la dénaturation thermique est effectuée par le QIAcube.

La durée moyenne de préparation des échantillons (fondée sur les données de 12 préparations d’échantillons) est de 125 minutes, dont seulement 20 minutes environ de manipulation.

Lorsque le kit est utilisé conjointement aux tubes PAXgene Blood RNA, le système fournit de l’ARN intracellulaire de sang total pour la RT-PCR utilisée dans le test de diagnostic moléculaire.