Verogen ForenSeq MainstAY Kit

• La plus grande combinaison de STR connus dans une amplification
• Conforme aux exigences de l’Europe/du SWGDAM pour l’haplotype Y minimal, du CODIS, d’Interpol et de l’ESS
• Profils complets à partir d’une entrée d’ADNg de faible quantité
• Détecte les allèles dans des échantillons difficiles avec un équilibre supérieur et des taux de réussite élevés
• Séquence simultanément 96 échantillons par cycle
• Peut être téléchargé dans le NDIS pour les échantillons médicolégaux (pas de SE)

Ciblez les principaux STR autosomiques et STR Y avec la gamme de produits ForenSeq MainstAY, le moyen le plus accessible de générer des données très précises pour les tests courants de confirmation d’échantillons médicolégaux et pour la généalogie génétique en criminalistique. Choisissez entre deux options pertinentes sur le plan géographique, comme le ForenSeq MainstAY Kit compatible avec le NDIS qui est conçu pour prendre en charge la majorité des téléchargements de STR dans les bases de données nationales, ou le ForenSeq MainstAY SE Kit qui comprend le marqueur SE33 hautement polymorphe. En se concentrant sur les STR connus utilisés couramment dans les applications d’identification humaine et en entretenant la compatibilité avec les bases de données mondiales, les produits MainstAY facilitent la transition vers le séquençage à haut débit. La procédure ForenSeq, éprouvée et maîtrisée, permet de générer des profils ADN plus complets pour 96 échantillons de preuve maximum en moins de 2 heures de manipulation.

Le ForenSeq MainstAY constitue un point de transition simple pour intégrer le séquençage à haut débit (NGS) à votre procédure de fonctionnement. Le NGS prend en charge le typage simultané de diverses catégories de STR dans une même réaction, cela permet d’extraire le maximum d’informations d’un échantillon de criminalistique. Le NGS associe en outre la capacité de distinction des STR avec une variation de séquence supplémentaire, qui peut résoudre les isoallèles dans un STR. Le ForenSeq MainstAY Kit contient des réactifs pour amplifier 27 locus STR autosomiques et 25 STR Y en petits amplicons et générer des données de séquençage sur le MiSeq FGx Sequencing System à l’aide du MiSeq FGx Reagent Micro Kit. Dans cette procédure, il est possible d’identifier dans une même amplification le polymorphisme de longueur des séquences et des allèles dans les STR Au et STR Y. Il n’est plus nécessaire d’exécuter plusieurs procédures et cela accroît la valeur informative d’un échantillon de criminalistique, augmentant ainsi la puissance statistique de l’inclusion. Le NGS élimine aussi le problème du chevauchement des allèles, ce qui permet aux utilisateurs d’interroger davantage d’allèles dans le multiplexe.

• La combinaison des locus STR et de l’amélogénine est un outil puissant de l’identification humaine
• Entretient la compatibilité avec les bases de données mondiales existantes
• La faible entrée recommandée de 1 ng d’ADNg donne un taux de réussite élevé reproductible
• Analyse des données de séquençage dans une interface pratique et facile à utiliser dans le module d’analyse MainstAY
• Génère des rapports en moins de 1,5 jour

L’ajout de 27 STR Au, 25 STR Y et de l’amélogénine dans une même réaction offre un taux de vraisemblance attendu supérieur à celui des kits de STR autosomiques les plus courants et permet la comparaison directe de profils à source unique (p. ex. recherche dans une base de données et partage de données à l’international), quel que soit le dosage utilisé pour faire le typage de l’échantillon de comparaison. Le profil génétique généré par le ForenSeq MainstAY permet de rechercher des échantillons médicolégaux avec STR Au et des haplotypes dans une base de données de STR Y. Les STR Y produisent un profil d’haplotype à partir d’ADN masculin, ce qui les rend très utiles en cas de mélange d’ADN masculin/féminin. En présence d’un seul contributeur masculin, ils peuvent permettre d’exclure les contributeurs masculins potentiels.

Le nombre maximal de banques pouvant être séquencées simultanément dépend du nombre de lectures ou de la profondeur de couverture (Depth of coverage, DoC) souhaitée par locus. Une couverture de lecture équilibrée sur les amplicons est également primordiale pour la récupération des locus et des allèles. Le ForenSeq MainstAY Kit présente un petit nombre de marqueurs multiplexés dans une seule réaction de séquençage, ce qui donne une couverture globale importante. L’équilibre interlocus a été déterminé à l’aide de banques MainstAY à partir de 1 ng d’ADN issu de 46 échantillons Coriell masculins, incluant un contrôle d’amplification positif, de 49 échantillons Coriell féminins et d’un NTC. La couverture moyenne sur les STR Au et les STR Y pour les échantillons masculins était respectivement de 669 et 469 lectures. La couverture moyenne pour les STR Au pour les échantillons féminins était de 1 065 lectures. La différence entre les STR Au ayant la profondeur de couverture maximale et minimale était ×15, tandis que la différence entre les STR Y ayant les nombres maximal et minimal de lectures était ×4,6 (voir la figure « Profondeur de couverture moyenne pour les marqueurs du ForenSeq MainstAY Kit »). L’équilibre interlocus médian pour les échantillons masculins, exprimé en pourcentage du nombre total de lectures, était de 1,9 % (STR Au : 2,2 % et STR Y : 1,6 %). Pour les échantillons féminins, l’équilibre interlocus pour les STR Au était de 3,7 % (voir la figure « Équilibre interlocus pour les marqueurs génétiques du ForenSeq MainstAY Kit »).

L’équilibre intralocus (ILB) ou équilibre hérérozygote (HB) a été calculé comme le rapport entre le nombre minimal de lectures d’allèles et le nombre maximal de lectures d’allèles pour une paire hérérozygote. Comparé aux STR par CE, le NGS affiche une plage supérieure pour l’ILB due à des biais d’amplification pour les amplicons plus petits pendant la préparation de banque et le séquençage. L’ILB pour les paires de génotypage hétérozygotes et isométriques a été évalué avec des échantillons d’ADN de 1 ng dans cette étude pour chaque échantillon et locus. Tous les marqueurs du panel ont affiché des valeurs d’ILB supérieures à 60 %, avec un ILB médian de 86 %. La couverture et la faible variation du ForenSeq MainstAY Kit indiquent que les amplicons sont bien équilibrés, ce qui réduit la probabilité de décrochage de locus ou d’allèle et améliore l’identification de contributeurs mineurs dans un mélange (voir la figure « Équilibre intralocus pour les marqueurs génétiques du ForenSeq MainstAY Kit avec une entrée d’ADN de 1 ng »).

La capacité à générer des génotypes et des haplotypes sur diverses entrées a été évaluée trois fois avec de l’ADNg dilué en série dans des quantités de matrice de 1 ng, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62,5 pg, 31,25 pg, 15,625 pg et 7,82 pg. 96 banques ont été séquencées simultanément avec le MiSeq FGx Reagent Micro Kit. Le ForenSeq MainstAY Kit offre un seuil de sensibilité élevé, générant des profils complets (pas de perte d’allèle) et un taux de réussite de 100 % avec pas plus de 62,5 pg d’entrée d’ADN lorsque 96 banques ont été séquencées simultanément. Afin de déterminer le taux de réussite allélique et l’exactitude de comparaison des données de génotypage basées sur le séquençage, les génotypes et les haplotypes ont été générés avec le module d’analyse MainstAY dans le logiciel d’analyse universel en appliquant les paramètres par défaut, puis comparés aux données de génotypage orthogonales issues des méthodes de génotypage classiques (détection de longueur de fragment par CE pour les STR). Les STR Au ont affiché une concordance de 100 % à 62,5 pg, avec une concordance de 95 % même à 31 pg. Les STR Y ont affiché une concordance de 100 % à 125 pg, avec une concordance de 91 % à 31 pg. Tous les résultats discordants étaient issus du stutter qui a dépassé le filtre de stutter par défaut défini pour des échantillons de 1 ng (voir la figure « Étude de sensibilité avec des échantillons d’ADNg dilué en série amplifiés trois fois »).

Pour évaluer la concordance des génotypes et des haplotypes générés par le ForenSeq MainstAY Kit, 31 banques incluant les étalons NIST SRM 2391d, des ADN Coriell, un contrôle d’amplification positif et trois NTC ont été préparées puis séquencées trois fois. Les données ont été analysées à l’aide du module d’analyse MainstAY dans le logiciel d’analyse universel avec les seuils d’analyse et filtres de stutter par défaut. L’exactitude des allèles des génotypes et des haplotypes a été déterminée en comparant avec les données CE orthogonales. La précision et les taux de réussite ont été déterminés grâce à des expériences de répétabilité et de reproductibilité dans lesquelles des banques étaient préparées puis séquencées quatre fois à partir de 15 échantillons d’ADN de contrôle avec un contrôle d’amplification positif et trois NTC, par trois opérateurs sur trois instruments MiSeq FGx distincts. Une exactitude élevée a été observée dans les STR Au (99,82 %) et les STR Y (100 %). Six allèles discordants ont été détectés sur 3 261 allèles de STR Au. Aucun allèle discordant n’a été détecté sur les 774 allèles de STR Y. De même, des taux de précision élevés de 99,87 % et 99,42 % ont été observés respectivement pour les STR Au et les STR Y. Toutes les différences ont été attribuées aux allèles de stutter dépassant les filtres de stutter par défaut.

Pour évaluer la capacité du ForenSeq MainstAY Kit à détecter les allèles mineurs dans de petits contributeurs, des mélanges d’échantillons féminins et masculins de contrôle ont été générés à 1 ng, avec l’échantillon féminin en contributeur majeur. Le pourcentage du contributeur mineur dans le mélange va de 50 % à 0,2 %. Le nombre d’allèles uniques, non partagés du contributeur d’allèles mineurs dans le mélange a été évalué à l’aide des seuils d’analyse et d’interprétation par défaut et des filtres de stutter dans le module d’analyse MainstAY dans le logiciel d’analyse universel (voir la figure « Mélanges d’échantillons d’ADNg de contrôle féminins/masculins à des niveaux dilués en série du contributeur mineur »). Avec un contributeur mineur de 50 %, 31 allèles autosomiques mineurs uniques et 27 allèles Y ont été détectés. Environ 15 allèles autosomiques mineurs uniques (50 % d’allèles STR AU uniques) et 26 allèles Y ont été détectables avec une contribution mineure de 5 %. Avec une contribution mineure de 1 %, plus de 10 locus STR Y étaient détectables. Le ForenSeq MainstAY permet d’identifier correctement les contributeurs mineurs dans un mélange, même si les contributions sont faibles.

La capacité de typage des génotypes et haplotypes d’échantillons d’ADN dégradés avec la procédure ForenSeq MainstAY a été évaluée avec de l’ADNg partiellement dégradé semblable aux échantillons de criminalistique soumis aux éléments et à des contraintes chimiques. Avec 1 ng de sang dégradé provenant de 30 échantillons, 1 contrôle d’amplification positif et un NTC, des banques ont été préparées et séquencées trois fois à l’aide du Miseq FGx Reagent Micro Kit. L’indice de dégradation (DI) a permis d’évaluer la qualité des échantillons des banques. Les échantillons avec un DI de 1 à 4 étaient considérés comme non dégradés, ceux avec un DI de 4 à 10 étaient considérés comme modérément dégradés et ceux avec un DI de > 10 étaient considérés comme sévèrement dégradés. Les échantillons testés avec le MainstAY présentaient un DI de 1 à 56, les échantillons étaient donc faiblement, modérément et fortement dégradés. Tous les STR ont bénéficié d’un typage de précision dans les échantillons non dégradés. Les échantillons présentant une dégradation modérée affichaient un taux de réussite de > 85 % pour les STR typés avec précision, et les échantillons sévèrement dégradés affichaient un taux de réussite de > 71 %, indiquant une perte minime des STR amplifiables. L’échantillon avec le DI le plus élevé, 56, affichait une récupération d’allèles de 60 % (40 sur 74). Le ForenSeq MainstAY permet la détection d’un grand nombre d’allèles même à partir d’échantillons sévèrement dégradés (voir la figure « ADN génomique extrait à partir d’échantillons de sang dégradés »).

La procédure ForenSeq MainstAY est intégrée à l’analyse ForenSeq bien connue qui est au cœur de la gamme de préparation de banque Verogen. Ce dosage par PCR sensible amplifie efficacement 53 marqueurs avec les identifiants doubles uniques (UDI) intégrés, générant ainsi des amplicons courts qui augmentent la probabilité de détection d’allèles à partir d’ADN dégradé. Un volume initial d’extrait d’ADN de 8 μl permet d’obtenir des échantillons de faible concentration et de diluer les échantillons inhibés.

Cette solution sous forme de kit complet comprend un contrôle d’amplification positif, ce qui facilite l’achat et l’étalonnage. Le kit permet le séquençage et l’analyse de 96 échantillons maximum sur le MiSeq FGx Reagent Micro Kit à l’aide de la capacité de lecture en paire du MiSeq FGx Sequencing System, cela optimise le débit d’échantillons et limite le coût de chaque échantillon. La faible entrée d’ADNg recommandée de 1 ng permet une récupération fiable et reproductible des profils complets à partir d’échantillons à source unique de grande qualité, même avec une entrée ne dépassant pas 62,5 pg et des échantillons difficiles.

Le ForenSeq MainstAY Kit permet une procédure complète en moins de 30 heures lorsqu’il est utilisé avec le MiSeq FGx Sequencing System, le MiSeq FGx Reagent Micro Kit et le module d’analyse MainstAY dans le logiciel d’analyse universel (UAS). Le module d’analyse MainstAY permet une exploration guidée, une visualisation intéressante avec des aperçus des projets et des échantillons, et des vérifications précises des recherches d’allèles STR avec de grandes capacités de filtrage et de tri. Il permet également de générer des rapports interprétables par l’utilisateur qui peuvent être exportés dans divers formats. Cette procédure intégrée constitue un point de départ économique pour les laboratoires qui envisagent le NGS pour leurs applications criminalistiques.

La procédure comprend cinq limites de sécurité et une plaque d’adaptateur prémélangée qui renforce l’efficacité et la facilité de la préparation de banque. La procédure est compatible avec de nombreuses sources courantes pour l’ADN en criminalistique, comme l’ADNg extrait, les lysats bruts et les découpes de carte type FTA en milieu de conservation.

• Une analyse focalisée et performante des échantillons médicolégaux volumineux

Interrogez simultanément l’ensemble le plus important de locus bien caractérisés comprenant 27 STR autosomiques et 25 STR Y pour 96 échantillons maximum. Générez des profils équilibrés compatibles avec toutes les bases de données de STR existantes avec pas plus de 100 pg. Analysez efficacement les données avec très peu d’interaction avec le module d’analyse et faites votre choix parmi diverses options d’exportation prêtes à télécharger compatibles avec les bases de données régionales.

• Des données plus pertinentes, pour le même prix

Obtenez des données très précises pour les principaux locus STR du CODIS et de l’ESS en un même cycle d’amplification et séquençage, pour un coût comparable à l’analyse CE classique. Découvrez toute la puissance du séquençage à haut débit, quel que soit votre débit, grâce à deux tailles de kits de séquençage.

• Intégration complète et assistance

La procédure complète est basée sur le processus ForenSeq établi, permettant une grande variété d’analyses ADN sur une même plate-forme éprouvée. Le ForenSeq MainstAY Kit s’intègre parfaitement dans l’UAS pour une évaluation rapide des données et la création de rapports d’un simple clic.

Le module d’analyse MainstAY du logiciel d’analyse universel (UAS) permet d’évaluer les données de séquençage avec des scores de qualité, des seuils et des aides que vous connaissez déjà. Des paramètres d’analyse préconfigurés sont proposés dans la solution, le laboratoire peut les modifier si nécessaire. De plus, ce module est conçu pour accroître les performances opérationnelles des grands laboratoires de criminalistique, il présente un aperçu simplifié des projets et des échantillons qui facilite la vérification des marqueurs avec indicateurs de CQ. De nouvelles possibilités de tri et de filtrage permettent aux utilisateurs de classer et évaluer une sous-série de STR à l’aide de divers indicateurs de CQ. Une analyse plus simple des séquences d’allèles STR provenant de populations d’allèles mélangés, de type hétérozygotes isométriques, est possible en naviguant facilement entre les recherches d’allèles et les informations sur les séquences.

Nous proposons une assistance optimale tout au long de la procédure, de la préparation de banque au séquençage en passant par l’analyse. Notre équipe d’experts offre un service complet pour vos équipements, logiciels et plans de validation, et vous guide pour l’installation pour que vous puissiez utiliser vos procédures rapidement et facilement.