Cat. No. / ID: 204443
Les QuantiTect RT-PCR Kits permettent une quantification sensible des cibles ARN par PCR en temps réel en une étape à l’aide de sondes spécifiques de la séquence ou en détectant le SYBR Green I. Les kits permettent également de quantifier de manière fiable jusqu’à 5 cibles ARN dans un seul tube par RT-PCR multiplex, en temps réel et en une seule étape. La combinaison d’un hot start et d’un système de tampon PCR unique dans le mélange principal prêt à l’emploi garantit une qRT-PCR très sensible sur n’importe quel thermocycleur en temps réel, sans besoin d’optimisation. Le mélange de dNTP comprend du dUTP ce qui permet un traitement optionnel à l’UNG. Pour plus de commodité, les mélanges principaux des kits RT-PCR en une étape QuantiTect peuvent être conservés entre 2 et 8 °C.
Deux formats de kits sont disponibles pour la RT-PCR multiplex utilisant des sondes spécifiques de la séquence : le kit QuantiTect Multiplex RT-PCR pour les thermocycleurs qui nécessitent le colorant ROX pour la normalisation de la fluorescence et le kit QuantiTect Multiplex RT-PCR NoROX pour tous les autres thermocycleurs. Le QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit est fourni avec un mélange RT optimisé pour une transcription inverse efficace et sensible sur une large plage de quantités de matrice d’ARN.
La HotStarTaq DNA Polymerase incluse dans les kits QuantiTect de RT-PCR en une étape augmente la spécificité de la réaction PCR en fournissant le hot start le plus strict comparativement à d’autres polymérases.
Le kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR contient un mélange unique de transcriptases inverses, qui permet une synthèse efficace et sensible de l’ADNc sur un grand nombre de quantités de matrice d’ARN et permet une quantification spécifique sur une large plage linéaire (voir la figure « Résultats comparables en RT-PCR en une étape et en deux étapes. »).
Le QuantiTect Probe RT-PCR Kit contient une matrice RT-PCR unique qui favorise la renaturation hautement spécifique des amorces et des sondes sur la matrice PCR. La HotStarTaq DNA Polymerase et la composition unique du tampon RT-PCR permettent au QuantiTect Probe RT-PCR Kit de fournir une quantification sensible des cibles d’ARN à faible taux de copie, ainsi qu’une quantification précise sur une large plage linéaire (voir la figure « Une sensibilité et une efficacité élevées, ainsi qu’une large plage dynamique »).
L’exécution séquentielle de la transcription inverse et de la PCR dans le même ’ ne nuit pas à la sensibilité, comme le montrent les valeurs CT comparables à celles obtenues lors de la RT-PCR en temps réel en deux étapes (voir les figures « RT-PCR en une étape présentant des performances comparables à celles de la RT-PCR en deux étapes – A » et « RT-PCR en une étape présentant des performances comparables à celles de la RT-PCR en deux étapes – B », ainsi que le tableau « RT-PCR en une étape présentant des performances comparables à celles de la RT-PCR en deux étapes »).
RT-PCR en une étape présentant des performances comparables à celles de la RT-PCR en deux étapes.
Quantité d’ADNc/ARN |
Valeur moyenne de Ct (RT-PCR en deux étapes) |
Valeur moyenne de Ct (RT-PCR en une étape) |
---|---|---|
100 ng | 24,66 | 24,66 |
10 ng | 28,15 | 27,84 |
1 ng | 31,42 | 31,49 |
0,1 ng | 34,80 | 34,56 |
0,01 ng | 37,78 | 37,66 |
La détection sensible de seulement 10 copies de la séquence cible (voir figure « Détection jusqu’à 10 copies de l’ARN cible par PCR duplex ») peut être réalisée en qRT-PCR multiplex avec les QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits. La quantification relative précise de l’expression d’un gène est obtenue en quantifiant l’expression du gène cible et d’un gène de contrôle endogène dans le même puits ou le même tube. Avec les kits QuantiTect Multiplex RT-PCR, les valeurs CT pour les cibles dans une réaction multiplex sont équivalentes à celles obtenues dans des expériences de contrôle où les cibles sont amplifiées dans des réactions séparées (voir figure « Amplification comparable dans les PCR triplex et PCR singleplex »). Cela démontre que les différentes cibles dans la même réaction multiplex sont amplifiées de manière efficace et sensible sans s’influencer les unes les autres.
Les QuantiTect RT-PCR Kits contiennent un mélange principal optimisé et prêt à l’emploi pour une quantification en temps réel hautement spécifique et sensible des cibles ARN à l’aide du SYBR Green I ou de sondes spécifiques à une séquence. Le colorant fluorescent SYBR Green I contenu dans le mélange principal QuantiTect SYBR Green RT-PCR permet l’analyse de nombreuses cibles différentes sans avoir à synthétiser des sondes marquées spécifiques à la cible (voir tableau « Composants du 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit »).
Composants du 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit
Composant | Caractéristiques | Avantages |
---|---|---|
HotStarTaq DNA Polymerase | 15 min d’activation à 95 ºC | Réglage des réactions qPCR à température ambiante |
QuantiTect SYBR Green RT-PCR Buffer | Combinaison équilibrée d’ions NH4+ et K+ | La renaturation spécifique des amorces garantit des résultats fiables de la PCR |
Mélange dNTP | Comprend du dUTP, qui remplace partiellement le dTTP et permet un traitement UNG optionnel des réactions | Élimine la contamination de transfert des produits PCR grâce au traitement UNG optionnel |
Colorant SYBR Green I | Produit un signal fluorescent puissant lors de la liaison de l’ADN double brin | Quantification très sensible |
Colorant ROX | Pour la normalisation des signaux fluorescents sur les appareils Applied Biosystems et, en option, Agilent | Quantification précise sur les thermocycleurs qui nécessitent le colorant ROX. N’interfère pas avec les réactions sur d’autres thermocycleurs en temps réel |
Transcriptases inverses Omniscript et Sensiscript | Mélange spécial d’enzymes ayant une grande affinité pour l’ARN | L’ARN peut être transcrit même à travers des structures secondaires complexes |
Les QuantiTect Probe RT-PCR Kits contiennent un mélange principal optimisé et prêt à l’emploi pour la quantification en temps réel hautement spécifique et sensible des cibles ARN à l’aide de sondes spécifiques de la séquence (voir le tableau « Composants de 2x QuantiTect Probe RT-PCR Kit »). Les kits sont conçus pour être utilisés avec tous les types de sondes spécifiques à une séquence, y compris les sondes d’hydrolyse (par exemple, TaqMan® et autres sondes à double marquage), les sondes FRET et les balises moléculaires.
Composants de 2x QuantiTect Probe RT-PCR Kit
Composant | Caractéristiques | Avantages |
---|---|---|
HotStarTaq DNA Polymerase | 15 min d’activation à 95 ºC | Réglage des réactions qPCR à température ambiante |
QuantiTect Probe RT-PCR Buffer | Combinaison équilibrée d’ions NH4+ et K+ | La renaturation spécifique des amorces garantit des résultats fiables de la PCR |
Mélange dNTP | Comprend du dUTP, qui remplace partiellement le dTTP et permet un traitement UNG optionnel des réactions | Élimine la contamination de transfert des produits PCR grâce au traitement UNG optionnel |
Colorant SYBR Green I | Produit un signal fluorescent puissant lors de la liaison de l’ADN double brin | Quantification très sensible |
Colorant ROX | Pour la normalisation des signaux fluorescents sur les appareils Applied Biosystems et, en option, Agilent | Quantification précise sur les thermocycleurs qui nécessitent le colorant ROX. N’interfère pas avec les réactions sur d’autres thermocycleurs en temps réel |
Transcriptases inverses Omniscript et Sensiscript | Mélange spécial d’enzymes ayant une grande affinité pour l’ARN | L’ARN peut être transcrit même à travers des structures secondaires complexes |
La quantification relative précise de l’expression d’un gène est obtenue en quantifiant l’expression du gène cible et d’un gène de contrôle endogène dans le même puits ou le même tube. Le mélange principal optimisé du RT-PCR multiplex QuantiTect Kit garantit que les produits PCR dans une réaction multiplex sont amplifiés avec la même efficacité et la même sensibilité que les produits PCR dans une réaction d’amplification simple correspondante (voir le tableau « Composants du RT-PCR multiplex 2x QuantiTect Kit »). Le kit permet de détecter jusqu’à 10 copies d’un gène cible.
Composants du 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit
Composant | Caractéristiques | Avantages |
---|---|---|
HotStarTaq DNA Polymerase | 15 min d’activation à 95 ºC | Réglage des réactions qPCR à température ambiante |
QuantiTect Multiplex RT-PCR Buffer | Combinaison équilibrée d’ions NH4+ et K+ | La renaturation spécifique des amorces garantit des résultats fiables de la PCR |
Synthetic Factor MP | Analyse multiplexe fiable d’un maximum de 4 gènes dans le même tube | |
Mélange dNTP | Comprend du dUTP, qui remplace partiellement le dTTP et permet un traitement UNG optionnel des réactions | Élimine la contamination de transfert des produits PCR grâce au traitement UNG optionnel |
Colorant ROX* | Pour la normalisation des signaux fluorescents sur les appareils Applied Biosystems et, en option, Agilent | Quantification précise sur les thermocycleurs qui nécessitent le colorant ROX. N’interfère pas avec les réactions sur d’autres thermocycleurs en temps réel |
Transcriptases inverses Omniscript et Sensiscript | Mélange spécial d’enzymes ayant une grande affinité pour l’ARN | L’ARN peut être transcrit même à travers des structures secondaires complexes |
La combinaison équilibrée d’ions K+ et NH4+ dans le tampon PCR des QuantiTect RT-PCR Kits – Plus un unique Factor MP synthétique dans le tampon QuantiTect Multiplex RT-PCR – Favorise une renaturation spécifique des amorces, permettant une spécificité et une sensibilité élevées de la RT-PCR (voir figure « Renaturation spécifique des amorces »). De plus, un mélange optimisé de transcriptases inverses permet la synthèse d’ADNc à partir d’une large plage de quantités de matrice d’ARN, tandis que la HotStarTaq DNA Polymerase assure un hot start rigoureux, empêchant la formation de produits non spécifiques.
Les QuantiTect RT-PCR Master Mixes contiennent également du dUTP, ce qui permet un prétraitement avec l’uracil-N-glycosylase (UNG) avant de commencer la PCR, ce qui garantit que tout produit PCR contaminant n’affecte pas les réactions PCR ultérieures.
Les QuantiTect RT-PCR Kits permettent de s’affranchir de l’optimisation des conditions de réaction, qui peut s’avérer fastidieuse et chronophage. Il suffit d’ajouter les amorces et la matrice au QuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix prêt à l’emploi ou les amorces, la sonde et la matrice au QuantiTect Probe RT-PCR master mix prêt à l’emploi et de démarrer la réaction (voir le diagramme « RT-PCR en une étape à l’aide de SYBR Green » et « RT-PCR en une étape à l’aide de sondes spécifiques à une séquence »). Suivez le protocole du manuel pour obtenir des résultats rapides et fiables sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Si nécessaire, il est possible de prétraiter les réactions avec de l’uracile-N-glycosylase (UNG) afin d’éliminer le transfert des produits de PCR des réactions précédentes.
La combinaison des QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kits et des QuantiTect Primer Assays garantit des résultats hautement spécifiques dans l’analyse de l’expression des gènes. Il s’agit d’ensembles d’amorces validés sur le plan bioinformatique et couvrant l’ensemble du génome, qui permettent de détecter des transcriptions chez l’homme, la souris, le rat et de nombreuses autres espèces. Vous pouvez facilement commander les dosages d’amorces QuantiTect en ligne sur le site de GeneGlobe.
Le manuel des QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits contient un protocole unique que vous pouvez utiliser avec tous les thermocycleurs disponibles, ainsi qu’une liste des colorants recommandés. Les kits sont disponibles avec ou sans colorant de référence passif ROX dans le mélange principal, ce qui permet de les utiliser sur pratiquement tous les thermocycleurs en temps réel (voir le tableau « Choix du QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit approprié »). L’analyse automatique des données permet de détecter même les faibles nombres de copies grâce aux concentrations optimisées de ROX.
Choix du QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit approprié
Colorant ROX | Kit | Thermocycleurs compatibles |
---|---|---|
Fourni dans le mélange principal | QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit | Thermocycleurs d’Applied Biosystems |
Absent du mélange principal | QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Rotor-Gene cyclers, et thermocycleurs de Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche, Agilent, et d’autres fournisseurs |
Les QuantiTect RT-PCR Kits permettent l’analyse de l’expression génétique des cibles ARN sur n’importe quel thermocycleur en temps réel. Il s’agit notamment des appareils d’Applied Biosystems, de Bio-Rad, de Cepheid, d’Eppendorf, de Roche et d’Agilent. Pour le Rotor‑Gene Q et les autres thermocycleurs Rotor-Gene, nous recommandons d’utiliser le Rotor-Gene Probe RT-PCR Kit, le Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit ou le Rotor-Gene SYBR Green RT-PCR Kit, qui ont été spécialement développés pour les thermocyclages rapides sur ces appareils.
Caractéristiques | QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit | QuantiTect Probe RT-PCR Kit | QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits |
---|---|---|---|
Applications | Quantification en temps réel des cibles d’ARN | Quantification en temps réel des cibles d’ARN | Quantification en temps réel des cibles d’ARN dans un format multiplex |
Type de réaction | RT-PCR en une étape | RT-PCR en une étape | RT-PCR multiplex en une étape |
Temps réel ou point final | Temps réel | Temps réel | Temps réel |
Type d’échantillon/de cible | ARN | ARN | ARN |
Simple ou multiplex | Unique | Unique | Unique |
SYBR Green I ou sondes à une séquence spécifique | SYBR Green I | Sondes spécifiques à une séquence | Sondes spécifiques à une séquence |
Thermocycleur | Tous les thermocycleurs en temps réel (par exemple, LightCycler, Rotor-Gene, ABI) | Tous les thermocycleurs en temps réel (par exemple, LightCycler, Rotor-Gene, ABI) | Thermocycleurs en temps réel dédiés à la PCR multiplex (par exemple, la plupart des thermocycleurs en temps réel d’Applied Biosystems, le LightCycler 480 de Roche et l’iCycler iQ de Bio-Rad) |
Avec ou sans ROX | Avec ROX | Avec ROX | Avec ROX ou sans |