QuantiNova LNA PCR Assays para PCR digital

• Más de 1,3 millones de ensayos proporcionan la mejor y más amplia cobertura de transcritos de ARNm y ARNInc humano y murino en Ensembl
• Sensibilidad y especificidad excepcionales con cebadores mejorados con LNA breves
• Detección exacta en un amplio intervalo dinámico que comienza en una copia de ARN
• Optimizado para eliminar amplificación inespecífica
• Cuantificación absoluta de cambios de expresión con dPCR mediante el uso del instrumento QIAcuity y el QIAcuity EG PCR Kit

Los QuantiNova LNA PCR Assays están estableciendo un nuevo estándar en análisis de expresión génica basado en PCR digital. Elija entre la más amplia variedad de ensayos prediseñados para la detección exacta y sensible de cualquier ARN mensajero o ARN largo no codificante, humano o murino: desde la detección del transcrito general hasta la diferenciación de isoformas de transcrito específicas. La mejora con LNA nos permite diseñar cebadores más breves, que son más flexibles a la posición en el blanco. Como resultado, podemos optimizar nuestros diseños para la detección de transcritos específicos o la diferenciación de blancos. Además, la minuciosa validación del diseño garantiza un rendimiento óptimo y una detección sólida. Para la PCR digital, hemos optimizado los ensayos con los QIAcuity EG PCR Kits y el instrumento QIAcuity, y hemos creado un flujo de trabajo de cuantificación simple, rápido y absoluto que solo supone 2 horas.

¿Planea usar los QuantiNova LNA PCR Assays en el análisis de qPCR? Puede buscar detalles específicos del producto y del rendimiento de la qPCR en la página del catálogo de qPCR específica.

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Análisis de PCR optimizado con los QIAcuity EG PCR Kits y el instrumento QIAcuity

Los QuantiNova LNA PCR Assays se desarrollaron para ofrecer amplificación de blancos de alta especificidad. Esto puede cuantificarse mediante dos métodos de PCR: qPCR con termocicladores en tiempo real estándar y PCR digital con el instrumento QIAcuity y el QIAcuity EG PCR Kit (consulte la figura Uso de QuantiNova LNA PCR Assays para PCR digital). Tras la síntesis de ADNc con el QuantiTect Reverse Transcription Kit, la PCR digital ofrece cuantificación de blancos de gran precisión, que permite detectar hasta los cambios de expresión más pequeños en las concentraciones más bajas. En el instrumento QIAcuity se ha validado experimentalmente un subconjunto de ensayos clave.

LNA mejora el rendimiento de la PCR

Los QuantiNova LNA PCR Assays han sido desarrollados con los criterios de diseño y los algoritmos validados por laboratorio más exigentes. El riguroso proceso de selección de ensayos garantiza que cada juego de cebadores ofrezca la más alta especificidad y eficacia para obtener los resultados más fiables y exactos. La normalización T_my la mejora con LNA le conceden a los cebadores una afinidad de unión superior a la de los cebadores de ADN estándar, lo que aumenta drásticamente la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

Este aumento en la sensibilidad asegura excelentes eficiencias de amplificación de hasta 1 molécula de ARN, permitiéndole detectar fácilmente blancos de bajos niveles de abundancia como los ARNInc de menos material de partida. La mayor especificidad producto de la ubicación inteligente del LNA le proporciona una alta relación señal-ruido, que permite discriminar las secuencias que se diferencian por un solo nucleótido y eliminar la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebador.

La alta afinidad de unión de las bases de LNA aumenta la flexibilidad de ubicación del cebador en el transcrito, por lo tanto, podemos usar la ubicación inteligente para diseñar ensayos para blancos que serían difíciles de analizar de otra manera. Esto le permite realizar una mejor discriminación de objetivos y una cuantificación fiable, incluso para los blancos con alto contenido de AU, los transcritos de bajos niveles de abundancia, los blancos con gran cantidad de estructura secundaria y las muestras altamente complejas.

Confíe en los expertos en diseño de LNA

Veinte años de experiencia en el diseño de LNA nos han permitido desarrollar y optimizar nuestro sofisticado diseño de LNA, que incorpora más de 50 parámetros diferentes, todos minuciosamente validados en laboratorio con criterios de rendimiento sumamente exigentes, para garantizar un ensayo óptimo para la correcta detección de blancos. Hemos seleccionado hasta tres diseños de ensayo diferentes para cada transcrito y hemos validado por completo en laboratorio químico todos los ensayos de blancos de ARNm y ARNInc más comunes. Los QuantiNova LNA PCR Assays funcionan, no es necesario que emplee tiempo ni dinero en optimización.

PCR digital basada en EvaGreen

Para lograr una cuantificación absoluta mediante dPCR, utilice los QuantiNova LNA PCR Assays junto con el QIAcuity EG PCR Kit, que utiliza detección de fluorescencia basada en EvaGreen. EvaGreen es un colorante intercalante que se une al ADN de doble cadena (de manera similar al SYBR^® Green) y se vuelve fluorescente al unirse al ADN. El uso de dPCR basado en EvaGreen proporciona practicidad y ahorro, ya que solo necesita el juego de cebadores para amplificar y detectar el producto. También proporciona una resolución más alta en la reacción de dPCR, que se divide en miles de partes de la nanoplaca para dPCR, por lo tanto, la concentración de cebador necesaria para la reacción de dPCR es apenas la mitad de la que se necesita para qPCR.

La cobertura más amplia y específica

Nuestro patentado algoritmo se ha utilizado para diseñar más de 1,3 millones de QuantiNova LNA PCR Assays con el objetivo de ofrecer el análisis de ARNm y ARNInc más sensible, exacto y eficaz. Los ensayos prediseñados cubren la mayoría de los transcritos de la base de datos Ensembl para genes humanos y murinos. Esto permite realizar estudios de expresión génica basados en PCR con la mayor exhaustividad posible. La mayoría de los ensayos se realiza mediante amplificación de intrones, si es posible, y solo detectan ARN. Los ensayos en los que no se amplifica un intrón están diseñados como tales y, si hay un exón en el blanco, las señales no deseadas pueden eliminarse fácilmente con el QuantiTect Reverse Transcription Kit siguiendo el paso de eliminación de ADNg integrado.

La elección del ensayo adecuado para su blanco

Los QuantiNova LNA PCR Assays prediseñados le permiten detectar de forma exacta y sensible cualquier ARNm o ARNInc humano o murino, sin importar el nivel de análisis que necesite: detección de un transcrito general, detección de un transcrito específico o diferenciación de isoformas de transcrito.

La mayoría de los genes humanos y murinos tienen un solo transcrito, pero para aquellos que cuentan con varios, hemos seleccionado hasta tres ensayos por transcrito en los que se utiliza el mismo algoritmo. El diseño y la ubicación del cebador de estos ensayos varía para adaptarse a distintos requisitos de uso. Nuestra guía de selección de ensayos le ayuda a identificar rápidamente el mejor ensayo de cada categoría. Después de buscar ensayos para su blanco, revise los resultados y busque los ensayos recomendados que coincidan con el uso previsto:

• Mejor cobertura: para detección de transcritos generales
• Mejor ensayo de transcrito: para la detección de un transcrito específico
• Mejor ensayo específico de transcrito: para la diferenciación entre isoformas de transcritos específicos

Consulte la tabla siguiente para obtener más información.

Análisis de los datos de PCR digital

El QIAcuity Software Suite se utiliza para analizar los datos de dPCR e incluye una prueba de expresión génica que proporciona los resultados como múltiplo de variación y múltiplo de regulación con cifras listas para publicar.

Ensayos génicos de referencia para cualquier estudio

Se dispone de una amplia variedad de ensayos génicos de referencia humanos y murinos funcionalmente validados para permitir la normalización de datos de alta calidad y garantizar resultados fiables. Estos ensayos están dirigidos a ARN de codificación endógena, ARN extenso sin codificación y pequeñas moléculas de ARN nucleolar que generalmente se expresan constitutivamente en una amplia variedad de tejidos.

Normalización de qPCR de ARNm/ARNInc

La normalización elimina la variación técnica y biológica entre muestras que no está relacionada con los cambios biológicos en investigación. La debida normalización es fundamental para el correcto análisis e interpretación de los resultados de experimentos de real-time PCR. Lo más frecuente es que en la normalización se utilicen genes de referencia de expresión estable.

Por lo general, se recomienda analizar varios candidatos de genes de referencia de control endógeno antes de configurar el análisis de expresión de ARNm/ARNInc real. Estos candidatos deben elegirse entre genes de los que se espera una expresión estable durante todo el intervalo de muestras en investigación. Podrían ser ARNm o ARNInc de expresión estable seleccionados en función de bibliografía o datos preexistentes (p. ej., cribado de paneles de NGS o qPCR). El QuantiNova LNA PCR system ofrece ensayos de genes de referencia para ARN que suelen tener una expresión estable y, por lo tanto, son buenos candidatos como genes de referencia.

Todos los candidatos a genes de referencia deben estar empíricamente validados para cada estudio. Una opción para normalizar el panel de PCR al crear el perfil de una gran cantidad de ARNm/ARNInc es normalizar con la media global: el promedio de todos los ARNm/ARNInc expresados. Esta puede ser una buena opción en muestras con una alta tasa de éxito (genes expresados) pero debe utilizarse con cautela en muestras con bajas tasas de éxito. Tampoco es una buena opción en muestras para las cuales se modifica el nivel de expresión génica general.

RT-dPCR de dos pasos

Los mejores resultados se obtienen cuando se lleva a cabo la reacción de transcripción inversa con el QuantiTect Reverse Transcription Kit (n.º de catálogo 205311, 205313, 205314). No es recomendable usar el QuantiNova Reverse Transcription Kit. El ADNc resultante se cuantifica mediante dPCR con las mezclas maestras del QIAcuity EG PCR Kit en combinación con su elección del QuantiNova LNA PCR Assay.

Nota importante: Las cantidades de reacciones indicadas entre paréntesis después de los nombres de producto del ensayo corresponden al uso en qPCR. La PCR digital solo requiere la mitad de la concentración de cebador, pero los volúmenes de reacción son diferentes. Si utiliza la QIAcuity Nanoplate 26K, podrá configurar la misma cantidad de reacciones que se indicaron; si utiliza Nanoplate 8.5K podrá configurar 3,3 veces más. Consulte las instrucciones para dPCR en el manual de uso de QIAcuity.

Envío y entrega

Los QuantiNova LNA PCR Assays se envían a temperatura ambiente. Los ensayos en existencias se entregan en un plazo de 1 a 5 días. Durante el periodo de acceso inicial, se prevén tiempos de entrega más prolongados.

Lo que necesita para comenzar con la PCR digital con el QuantiNova LNA PCR system

Transcripción inversa: QuantiTect Reverse Transcription Kit (n.º de catálogo 205311, 205313, 205314)

Mezcla maestra para dPCR: QIAcuity EG PCR Kit

Ensayos:

• QuantiNova LNA PCR Assays
• QuantiNova LNA PCR Custom Assays

Los QuantiNova LNA PCR Assays están especialmente pensados para aplicaciones como:

• Análisis de expresión de ARNm y ARNInc, creación de perfiles y cuantificación
• Validación datos de expresión génica de secuencia de ARN
• Creación de perfiles de expresión génica
• Análisis de señales y trayectorias
• Confirmación de la inactivación de la expresión génica mediante siRNA o GapmeR de LNA
• Desarrollo de biomarcadores, incluyendo el cribado, la identificación y la validación de biomarcadores asociados con enfermedades
• Supervisión de cambios fenotípicos relacionados con la expresión génica