dPCR Copy Number Variation (CNV) Probe Assays

• Más de 200 ensayos validados en laboratorios de química y una herramienta personalizada para diseño de ensayos informáticos
• La selección de colorantes permite el multiplexado de hasta 5 dianas por reacción
• Gen de interés, ensayos de referencia y de referencia centromérica disponibles
• Ensayos listos para su uso que han sido validados para una gama de muestras, como las de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE), estirpes celulares y DNAg
• Flujo de trabajo de dPCR fácil y rápido en el QIAcuity
• Práctico análisis de datos del número de copias con el QIAcuity Software Suite

Los dPCR CNV Probe Assays permiten realizar un análisis del cambio en el número de copias específico, exacto, reproducible y fácil de interpretar de genes o zonas de interés en particular. Se han validado en un laboratorio de química de PCR ensayos para más de 200 dianas y se marcan como tal en la descripción del ensayo concreta.

Además, se dispone de una herramienta personalizada de diseño para abordar las necesidades de ensayo fuera de la oferta de ensayos validados en laboratorio de química.

Los dPCR CNV Probe Assays se encuentran disponibles en formato de tubo como ensayo concentrado 20 veces listo para usar. El tubo contiene el par de cebadores y una sondas de hidrólisis para su uso con el QIAcuity Probe PCR Kit (dianas de ADN), el QIAcuity Digital PCR System y QIAcuity Nanoplates .

Cada ensayo incluye la elección de cinco tipos de sondas de hidrólisis diferentes (fluoróforos): FAM, HEX, ROX, Atto 550 y Cy5. Esta flexibilidad permite la mezcla y la combinación de ensayos para análisis múltiples de hasta cinco dianas en una sola reacción de dPCR.

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Excelente rendimiento de los ensayos

Los dPCR CNV Probe Assays muestran una excelente amplificación del producto y una separación entre los grupos de partición negativos y positivos en un análisis doble con el uso de dos concentraciones distintas de molde de ADNg, (consulte los diagramas de dispersión de reacciones dobles 1D y 2D para los ensayos KRAS y TERT). Los resultados indican que el análisis exacto de CNV puede realizarse incluso a concentraciones bajas de entrada de ADNg. Para ver las cantidades mínimas y máximas de carga en las nanoplacas 8.5k, consulte la extensión del manual de usuario de QIAcuity.

Análisis del número de copias preciso y reproducible mediante la PCR digital

El sistema de QIAcuity dPCR altamente reproducible y los dPCR CNV Probe Assays permiten el análisis de CNV sin necesidad de réplicas, lo que incrementa el rendimiento de las muestras de forma rentable. Los análisis dobles de una muestra de ADNg obtuvo como resultado el número esperado de copias por genoma para todas las réplicas (consulte Análisis preciso y reproducible del número de copias en una reacción doble). En una prueba de precisión que analiza series de dilución de ADNg, los ensayos mostraron una distribución lineal excelente y una separación de grupos (consulte Distribución lineal en una prueba de precisión de series de dilución).

Análisis múltiple del número de copias mediante dPCR

El análisis múltiple realizado con los dPCR CNV Probe Assays eleva el rendimiento y reduce de forma significativa el coste del análisis por diana. La posibilidad de pedir estos ensayos con distintos colorantes (FAM, HEX, ROX, Atto 550 y Cy5) permite un diseño experimental flexible y análisis múltiples de hasta 5 dianas de forma simultánea en una sola reacción. Los dPCR CNV Probe Assays muestran una excelente amplificación y separaciones de grupos positivos y negativos para 5 ensayos multiplexados en una sola reacción (consulte Detección de CNV en una reacción 5-plex).

Todos los dPCR CNV Probe Assays están diseñados para zonas únicas del genoma humano. Los dPCR CNV Probe Gene of Interest Assays están dirigidos a genes muy estudiados del cáncer y relacionados con el cáncer. Los dPCR CNV Probe Reference Assays y los dPCR CNV Probe Centromeric Reference Assays incluyen una variedad de referencias con distintos números de copias por genoma, lo que hace posible la selección de referencias óptimas de normalización para cada análisis. En función de las condiciones experimentales, se puede incluir varios ensayos de genes de interés (GOI) y de referencia en las reacciones para un realizar un cálculo exacto del número de copias del gen o de la diana de interés.

Los dPCR Copy Number Probe Assays están listos para su uso: simplemente hay que añadir las mezclas de ensayo individuales a la muestra de ADN y la mezcla maestra del QIAcuity Probe PCR Kit, cargarlas en la QIAcuity Nanoplate e iniciar la serie en el instrumento QIAcuity. Cada ensayo se basa en una amplificación mediante PCR convencional de una región específica de genes de todo el genoma humano. El producto amplificado se detecta mediante el uso de sondas de hidrólisis fluorescentes específicas de la diana, que ayudan a asegurar una gran especificidad del ensayo.

El principio de la reacción de dPCR en las nanoplacas se describe aquí.

El proceso de configuración experimental es sencillo y directo y puede realizarse en cualquier laboratorio que utilice el instrumento QIAcuity dPCR. Para un análisis del número de copias más preciso, recomendamos seguir el aislamiento del ADN genómico de la muestra con una digestión con enzimas de restricción. No es necesaria la digestión de restricción para el ADN muy fragmentado (p. ej., ADN FFPE o ADN circulante) o el ADNc. Para realizar la digestión de restricción directamente en la mezcla de reacción, añada la enzima de restricción recomendada durante la preparación de la reacción. Es fundamental evitar el uso de enzimas de restricción que corten dentro de la región del amplicón diana.

A continuación, se mezcla el molde fragmentado con la mezcla maestra del QIAcuity Probe PCR Kit lista para usar y el dPCR CNV Probe Assay, y esta mezcla se alicuota en cada pocillo de la preplaca de dPCR. A continuación, se mezcla bien la mezcla de reacción mediante pipeteo y se transfiere a los pocillos de la QIAcuity Nanoplate. Se puede analizar cada gen o diana de interés y cada ensayo de referencia en un solo pocillo en una reacción múltiple mediante la combinación de estos con fluoróforos distintos.

Tras cargar y sellar la nanoplaca, se ejecuta el programa de ciclado recomendado en el instrumento QIAcuity. El resultado de las copias por microlitro se muestra en el tipo de análisis de cuantificación absoluta del QIAcuity Software Suite. Para calcular el número de copias por genoma, seleccione el tipo de análisis de datos del número de copias en el QIAcuity Software Suite y defina los pocillos de la nanoplaca para el gen o la región de interés, o la referencia de normalización. En función del protocolo de ciclado, los resultados de la serie de dPCR pueden analizarse en el QIAcuity Software Suite después de aproximadamente 2 horas.

Los dPCR CNV Probe Assays resultan ideales para detectar con exactitud alteraciones o variaciones en el número de copias en los locus individuales utilizando ADN de muestras nuevas, congeladas o fijadas.