QuantiNova RT-PCR Kits

• Procedimiento exclusivo de hot start en dos fases para una preparación a temperatura ambiente
• Control visual del pipeteo, que reduce los errores de pipeteo
• Control interno para la verificación positiva durante el proceso de la RT-PCR correcta
• Cuantificación exacta sobre varios logaritmos del molde
• Detección sensible de hasta 5 dianas en 1 tubo

Los QuantiTect RT-PCR Kits (kits de RT-PCR en tiempo real) permiten la cuantificación sensible de dianas de ARN mediante la PCR de un paso en tiempo real utilizando SYBR Green I o sondas específicas de secuencia. Una combinación de diferentes características de seguridad integradas elimina las variables y previene la aparición de artefactos, lo que garantiza la identificación de perfiles de expresión génica fiables. La combinación de un exclusivo hot start en dos fases y un sistema de tampón de PCR en la mezcla maestra lista para usar permite la preparación a temperatura ambiente y garantiza una qRT-PCR de alta sensibilidad en cualquier termociclador en tiempo real. El QuantiNova Internal Control RNA opcional puede utilizarse para comprobar la transcripción inversa y la amplificación correctas. Está previsto para notificar fallos en el instrumento o en la química, errores en la preparación de los ensayos y la presencia de inhibidores. Además, el control visual del pipeteo puede utilizarse para supervisar el pipeteo correcto. El paso integrado de reducción de ADNg del procedimiento de RT-PCR con sonda QuantiNova evita la cuantificación excesiva de transcritos que resulta del arrastre de ADN genómico.

El QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit permite la cuantificación rápida y fiable de hasta 5 dianas de ARN en un único tubo mediante la RT-PCR múltiple en tiempo real. Nuestra tecnología Q-Bond y la mezcla maestra optimizada favorecen la RT-PCR en tiempo real múltiple ultrarrápida en 1 hora. La combinación de un exclusivo procedimiento de hot start en dos fases y nuestro sistema de tampón de PCR múltiple garantiza una qRT-PCR de alta sensibilidad en cualquier termociclador en tiempo real sin necesidad de optimización, y permite la preparación de reacciones automatizada a temperatura ambiente. El kit también ofrece protocolos para ARN extraído y amplificación directa de células cultivadas, incluso con una sola célula. El QuantiNova Internal Control RNA opcional puede utilizarse para supervisar la transcripción inversa y la amplificación correctas, y el control visual del pipeteo puede utilizarse para supervisar el pipeteo correcto.

Indicador visual integrado para la preparación exacta de las reacciones

La mezcla maestra suministrada con los QuantiNova RT-PCR Kits contiene un colorante azul inerte que no interfiere en la transcripción inversa ni en la real-time PCR, pero sí aumenta la visibilidad en el tubo o en el pocillo. El QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer contiene un colorante amarillo inerte. Cuando el molde del ácido nucleico se diluye en el QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer y se añade a la mezcla maestra, el color de la solución cambia de azul a verde (consulte la figura “ Preparación exacta de las reacciones indicada por el control de pipeteo integrado”), lo que brinda una indicación visual de que cada reacción se configuró correctamente.

QuantiNova SYBR Green y QuantiNova Probe RT-PCR Kits

Los QuantiNova SYBR Green y QuantiNova Probe RT-PCR Kits utilizan un procedimiento de hot start en dos fases (consulte la figura “ Principio del nuevo mecanismo de hot start de QuantiNova”). Esto incluye la activación por calentamiento tanto para la transcriptasa inversa HotStaRT-Script a 50 °C (kits con SYBR Green y de análisis múltiple) o a 45 °C (kit con sonda) y la polimerasa para PCR a 95 °C. Con temperaturas bajas, HotStaRT-Script forma un complejo con una molécula que bloquea la RT, lo que provoca la inactivación. A 50 °C (kits con SYBR Green y de análisis múltiple) o a 45 °C (kit con sonda), el complejo se disocia y se libera la enzima HotStaRT-Script activa. La QuantiNova DNA Polymerase se mantiene en un estado inactivo por acción del anticuerpo QuantiNova Antibody y un nuevo aditivo, QuantiNova Guard, que estabiliza el complejo. De esta manera, se mejora la rigurosidad del procedimiento de hot start y previene la extensión de cebadores y de dímeros de cebador hibridados de manera no específica. A los 2 minutos (kits con SYBR Green y de análisis múltiple) o a los 5 minutos (kit con sonda) de haber alcanzado una temperatura de 95 °C, el QuantiNova Antibody y el QuantiNova Guard se desnaturalizan y se activa la QuantiNova DNA Polymerase, lo que permite la amplificación por PCR. Este exclusivo hot start en dos fases permite que la preparación de reacciones permanezca estable durante al menos 2 horas a temperatura ambiente (consulte la figura “ Cómoda preparación de reacciones a temperatura ambiente sin comprometer el rendimiento”), lo que previene la creación de artefactos y facilita la preparación de reacciones automatizada.

La QuantiNova DNA Polymerase y la composición única del tampón de RT-PCR proporcionan una cuantificación sensible de dianas de ARN de pocas copias, así como una cuantificación exacta en un amplio rango lineal (consulte la figura ““ Cuantificación exacta con cantidades de entrada muy altas o bajas””).

El paso de reducción de ADNg de los procedimientos de RT-PCR con sonda QuantiNova reduce al mínimo la cuantificación errónea que resulta del arrastre de ADN genómico. La reducción del ADN genómico es fundamental para obtener resultados de expresión génica exactos y elimina la necesidad de diseñar cebadores y sondas específicos del ARN. Con la reducción integrada del ADNg (consulte la figura “ Aumento de la fiabilidad de los resultados de la expresión génica mediante la reducción de ADNg”), se ahorra tiempo y se reducen los costes, dado que no es necesaria la hidrolización de ADNasa durante la purificación de muestras de ARN o después de ella.

El control interno desarrollado recientemente es un transcrito definido (molécula de ARN) que simplemente se puede añadir a las muestras y transcribirse en ADNc. Está previsto para notificar fallos en el instrumento o en la química, errores en la configuración de los ensayos o la presencia de inhibidores. Dado que el comportamiento del control interno es similar al de los transcritos reales (consulte la figura “ Seguimiento fiable de la inhibición de la RT-PCR”), se puede utilizar para confirmar la transcripción inversa y la amplificación correctas. La capacidad de análisis doble también permite incluir el control interno o un gen de referencia para la comparación directa con el gen diana.

La QuantiNova DNA Polymerase y la composición única del tampón de RT-PCR proporcionan una cuantificación sensible de dianas de ARN de pocas copias, así como una cuantificación exacta en un amplio rango lineal en cualquier termociclador común.

QuantiNova Multiplex RT-PCR Kits

La mezcla maestra especializada suministrada con el QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit permite la fácil preparación de reacciones múltiples y garantiza que los resultados sean similares a los de RT-PCR simple. La mezcla maestra cuádruple muy concentrada admite la entrada de molde de hasta 800 ng y ofrece una excelente sensibilidad, incluso en reacciones quíntuples.

El kit puede distinguir claramente entre pequeñas diferencias en la cantidad de molde y proporcionar una cuantificación exacta de las dianas con grandes diferencias en el nivel de abundancia (consulte la figura “ Detección múltiple muy sensible de dianas con diferentes niveles de abundancia”). Además, se proporciona un protocolo simple para la amplificación directa de células cultivadas, que permite el análisis de ARN incluso con una sola célula (consulte la figura “ Análisis de expresión génica múltiple en células individuales”). El exclusivo procedimiento de hot start en dos fases (consulte la figura “ Principio del nuevo mecanismo de hot start de QuantiNova”) garantiza la excelente especificidad y permite la preparación de reacciones a temperatura ambiente, lo que es adecuado para los procedimientos automatizados. El tampón de PCR especialmente desarrollado contiene el aditivo Q-Bond, que reduce de manera significativa los tiempos de hibridación y extensión, lo que permite realizar la qRT-PCR múltiple en aproximadamente una hora. La adición de un control visual de pipeteo aumenta la seguridad durante el proceso al reducir al mínimo el error humano (consulte la figura “ Preparación exacta de reacciones indicada por el control de pipeteo integrado”). El Internal Control RNA opcional, que puede detectarse junto con las dianas, elimina la variación que causan los inhibidores y otros factores, lo que permite supervisar la exactitud y la reproducibilidad. En general, nuestro flujo de trabajo de qRT-PCR múltiple ultrarrápido y controlado durante el proceso aumenta la eficacia al generar más información de una cantidad limitada de material de muestra.

Los QuantiNova RT-PCR Kits contienen mezclas maestras optimizadas y listas para usar para la cuantificación en tiempo real muy específica y sensible de dianas de ARN utilizando el colorante fluorescente SYBR Green I o sondas específicas de secuencia. El QuantiNova Probe RT-PCR Kit está diseñado para usarse con diferentes tipos de sondas específicas de secuencia, incluidas las sondas de hidrólisis (p. ej., TaqMan y otras sondas con doble marcador) y cebadores Scorpion. Los kits incluyen un tampón de PCR exclusivo que contiene una combinación equilibrada de iones de K⁺ y NH₄⁺, que favorece la hibridación de cebadores específicos, esto permite un alto nivel de especificidad y sensibilidad. Además, la HotStaRT-Script permite la síntesis de ADNc de una gran variedad de cantidades de molde de ARN, mientras que la QuantiNova DNA Polymerase proporciona un riguroso procedimiento de hot start, lo que impide la formación de productos no específicos. El procedimiento exclusivo de hot start en dos fases permite que la preparación de las reacciones se mantenga estable durante un máximo de dos horas a temperatura ambiente lo que respalda la preparación automatizada de reacciones.

El control visual integrado le permite comprobar si se ha añadido molde a la reacción y, así, evita los errores de pipeteo durante la preparación de reacciones.

La detección de variaciones en la síntesis de ADNc le permite comprobar la reproducibilidad de los resultados. El control interno desarrollado recientemente es un transcrito definido (molécula de ARN) que se puede añadir de manera opcional a las muestras y transcribirse en ADNc. Está previsto para notificar fallos en el instrumento o en la química, errores en la preparación de los ensayos y la presencia de inhibidores.

Para obtener resultados exactos en los ensayos de expresión génica con RT-PCR en tiempo real, es importante que solo se detecte y se amplifique ADNc. La interferencia debido al ADN genómico se evita al utilizar el paso de reducción de ADNg en los procedimientos de RT-PCR con sonda QuantiNova (consulte la figura “ Aumento de la fiabilidad de los resultados de expresión génica mediante la reducción de ADNg”). Se ahorra tiempo y se reducen los costes, dado que no es necesaria la hidrolización independiente de ADNasa durante la purificación de muestras de ARN o después de ella. Además, no es necesario diseñar cebadores o sondas específicos del ARN.
El QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit produce resultados muy sensibles y rápidos en un amplio rango dinámico en termocicladores estándar y rápidos sin optimización. El tampón de PCR especialmente desarrollado contiene el aditivo Q-Bond, que reduce de manera significativa los tiempos de hibridación y extensión. La amplificación de genes diana y de referencia en la misma reacción aumenta la fiabilidad al reducir al mínimo las variaciones entre pocillos y los errores de manipulación. Además, se suministra un Internal Control RNA y se puede detectar simultáneamente para supervisar la transcripción inversa y la qPCR correctas.

Los QuantiNova SYBR Green y Probe RT-PCR Kits no hacen necesaria la optimización de las condiciones de reacción, lo que puede ser tedioso y demandar mucho tiempo. Simplemente añada cebadores, molde de ARN y mezcla para RT a la mezcla maestra o RT-PCR lista para usar e inicie la reacción. Siga el protocolo del Manual de uso del QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit o del Manual de uso de QuantiNova Probe RT-PCR para obtener resultados rápidos y fiables en cualquier termociclador en tiempo real.

El QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit contiene una mezcla maestra cuádruple para PCR lista para usar, lo que elimina la necesidad de optimizar la reacción y las condiciones de termociclado. Simplemente añada la mezcla de RT, hasta 800 ng de ARN de molde y juegos de cebador-sonda a la mezcla maestra y siga el protocolo del manual de uso para obtener resultados rápidos y fiables en cualquier termociclador en tiempo real. El colorante de referencia ROX también se suministra en un tubo separado, por lo que la concentración puede ajustarse para su instrumento específico. El kit también ofrece un protocolo simple y rápido para la amplificación directa a partir de células cultivadas. La cantidad de entrada recomendada varía de 2000 células hasta una sola célula; p. ej., separación mediante dilución en serie o con el instrumento QIAscout. El QuantiNova Internal Control RNA (QN IC RNA) es un control interno de amplificación que puede utilizarse de manera opcional para comprobar la transcripción inversa y la amplificación correctas. Se detecta como un control interno de 200 bp en el canal amarillo del Rotor-Gene Q o en el canal de colorante VIC/HEX en otros instrumentos de real-time PCR cuando se utiliza el QuantiNova IC Probe Assay. Como alternativa, se puede detectar en el canal rojo del Rotor-Gene Q o en el canal de colorante Cy5 en otros instrumentos de real-time PCR cuando se utiliza el QuantiNova IC Probe Assay Red 650.

Para optimizar el flujo de trabajo, recomendamos combinar los QuantiNova Kits con nuestros ensayos o paneles de real-time PCR QuantiNova prediseñados. Estos ofrecen la cuantificación precisa del ARNm o transcritos de ARN extenso sin codificación, independientemente del nivel de abundancia. Elija entre una gran variedad de conjuntos de cebadores prediseñados de humano, ratón y rata, o personalice sus propios ensayos y paneles utilizando nuestras herramientas de diseño avanzado.
 
Nuestros QuantiNova LNA PCR y QuantiNova LNA Probe PCR Assays utilizan tecnología LNA para alcanzar mayor sensibilidad, lo que permite obtener perfiles de expresión génica sin sesgo y datos científicos más rápidos.

Para la detección basada en SYBR Green, pida el QuantiNova IC SYBR Green Assay (disponible con el nombre HS_QIC_2467742 QuantiNova LNA PCR Reference Assay y con el ID de GeneGlobe: SBH1218551) a través de nuestra plataforma GeneGlobe.

Nota: Antes, el QuantiNova IC SYBR Green Assay estaba disponible como QuantiTect Primer Assay for SYBR-based detection of IC RNA (n.° de cat. QT02589307).

Los QuantiNova SYBR Green y Probe RT-PCR Kits pueden utilizarse para el análisis de expresión génica de las dianas de ARN en cualquier termociclador en tiempo real. Esto incluye el Rotor-Gene Q e instrumentos de Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche y Agilent.

El QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit puede utilizarse para el análisis de expresión génica múltiple de dianas de ARN en cualquier termociclador en tiempo real. Para aprovechar al máximo el multiplexado, recomendamos utilizar un instrumento que ofrezca una capacidad hasta quíntuple, como el Rotor-Gene Q.