miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays

• Diseñe fácilmente un ensayo personalizado para su miARN específico de interés
• Detecte verdaderas señales en un rango de detección muy bajo, hasta 1 copia de miARN
• Flujo de trabajo rápido y sencillo que dura 2 horas
• Diseño de ensayo de miARN para cualquier miARN nuevo, isoforma de miARN o variante

Los miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays son juegos de sondas y cebadores de PCR de miARN que permiten una cuantificación sumamente sensible y específica del miARN con el miRCURY LNA miRNA Probe PCR System. Tanto el cebador directo de amplificación de PCR como la sonda etiquetada de supresor FAM y oscuro son específicos de miARN y están optimizados con tecnología de LNA, lo que impulsa el rendimiento del ensayo. Los ensayos se crean en línea de forma sencilla utilizando el mismo algoritmo robusto y optimizado que nuestros ensayos prediseñados. Por ello, los ensayos personalizados y prediseñados se pueden combinar y su funcionamiento está garantizado.

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Detección altamente sensible de señales verdaderas

La sensibilidad excepcional de los miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays se consigue al combinar la transcripción inversa universal con cebadores y sondas mejorados con LNA, normalizados con T_m y específicos de miARN. Esta combinación permite realizar una cuantificación precisa y fiable de miARN concretos a partir de tan solo 1 pg de ARN total o hasta 1 molécula sin preamplificación (consulte  Cuantificación precisa incluso con poco material de inicio y  Eficiencia excepcional en un amplio intervalo dinámico). La sensibilidad y el rápido flujo de trabajo hacen que el sistema sea particularmente adecuado para las muestras de suero o plasma y las enzimas de QuantiNova garantizan unos resultados altamente reproducibles entre las réplicas técnicas y biológicas en el primer intento, lo que ahorra material de muestras y tiempo.

En comparación con otros sistemas de PCR basados en sonda de miARN que depende solo de la sonda para generar especificidad, el cebador y la sonda mejorados con LNA de los miRCURY LNA miRNA Custom Probe Assays son específicos de miARN y lo suficientemente cortos como para evitar el solapamiento al unirse a la diana (consulte  Resumen de miRCURY LNA miRNA Probe PCR System), lo que mejora la sensibilidad, especificidad y eficiencia del ensayo. En combinación con una relación señal-ruido excelente (consulte  Detección precisa incluso con un fondo de ARN elevado), esta función única permite la discriminación de miARN estrechamente relacionada con diferencias de secuencia de tan solo un nucleótido (consulte  Potencia discriminatoria de hasta una diferencia de tan solo un nucleótido).

Validado y optimizado

Los diseños de ensayos (cebador y sonda) para los miARN nuevos están basados en un algoritmo de diseño creado por expertos en LNA y ensayos. Este exhaustivo algoritmo evalúa y optimiza 60 parámetros que están validados por ordenador frente a criterios de rendimiento muy rigurosos para garantizar un diseño que ofrece la mayor sensibilidad y especificidad. Los resultados son ensayos que pueden detectar hasta 1 copia de miARN.

Rápido y sencillo

Este protocolo fácil de seguir de 2 horas de duración ahorra tiempo y trabajo. Al utilizar una transcripción universal y protocolos de RT-PCR optimizados, el procedimiento se ha simplificado en gran medida en comparación con otras soluciones. Además, el ADNc generado en el paso de RT se puede utilizar en todo el miRCURY LNA miRNA Probe PCR System, lo que le permite hacer una transición fluida de los paneles a los ensayos en función de sus necesidades de investigación, además de ahorrar material de muestras y tiempo. El número de pasos de pipeteado se reduce al mínimo, lo que disminuye también la variación técnica. La robustez de los ensayos permite una preparación a temperatura ambiente y el retraso de ejecuciones para una mayor sensibilidad y el uso en automatización. Este flujo de trabajo, combinado con la elaboración de ensayos que cumplen la normativa ISO, permite alcanzar una reproducibilidad de un día para otro y de un centro a otro sumamente alta.

El proceso de diseño

La herramienta de diseño del miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assay le permite diseñar con más facilidad juegos de cebadores y sondas de PCR mejorados con LNA muy sensibles y específicos para cualquier miARN que no esté disponible como ensayo diseñado previamente. El algoritmo avanzado evalúa aproximadamente 3000 diseños de pares de cebadores y sondas basados en más de 60 criterios distintos para encontrar los cebadores y sondas de LNA óptimos para su miARN en pocos minutos. La herramienta se ha diseñado para los miARN pero también puede utilizarse para ARN pequeños de 14–27 nucleótidos de longitud.

Los criterios del diseño incluyen:

• Optimización de las temperaturas de disociación mediante la variación de la distribución del LNA de los cebadores y sondas para garantizar la alta eficiencia de amplificación y la especificidad.
• Cálculos y ajustes de las puntuaciones de autohibridación e hibridación cruzada para reacciones de PCR eficientes.
• Ajustes para evitar la posible formación de dímeros de cebador en la reacción de PCR.
• Posicionamiento inteligente de las bases de LNA en los cebadores y sondas de acuerdo con nuestro amplio conocimiento del diseño de oligonucleótidos de LNA.
• Búsquedas en miRBase para identificar posibles miARN con gran similitud de secuencia dentro de la misma especie. Esto garantiza que los juegos de cebadores y sondas sean muy específicos para el ARN pequeño para el que fueron diseñados.

Un sistema único para la cuantificación de miARN

El miRCURY LNA miRNA Probe PCR System permite una cuantificación y una creación de perfiles de miARN sensibles y específicas mediante real-time PCR. La detección se basa en una sonda de hidrólisis etiquetada de supresor FAM y oscuro. El sistema cubre todos los pasos relacionados con la conversión del miARN a ADNc y la detección posterior de qPCR de miARN. Los miRCURY LNA miRNA Custom Probe PCR Assays se han validado utilizando la QuantiNova Probe Master Mix; si se utilizan otros reactivos para la qPCR, esto afectará a los resultados.

RNA Spike-In Kit para RT

El RNA Spike-In Kit permite realizar un control de calidad de los pasos de aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y amplificación de PCR de los experimentos de miRCURY LNA miRNA Probe PCR para que pueda identificar cualquier muestra de calidad deficiente en una fase temprana del proceso y ahorrar tiempo y reactivos. El kit incluye UniSp2, UniSp4 y UniSp5 RNA Spike-in Template Mix y el cel-miR-39-3p RNA Spike-in Template.

miRCURY LNA RT Kit

Un kit de transcripción inversa universal para dos sistemas de detección. El miRCURY LNA RT Kit se utiliza tanto para el miRCURY LNA miRNA PCR System, que usa SYBR Green para la detección, como para el miRCURY LNA miRNA Probe PCR System basado en sonda. El kit incluye dos tampones de reacción específicos del sistema y todos los reactivos necesarios para realizar una poliadenilación y una transcripción inversa rápidas y cómodas de miARN en un único paso de reacción.

miRCURY Probe PCR Kit

Este kit, que está optimizado y especializado para el miRCURY LNA miRNA Probe PCR System, contiene la QuantiNova Probe Master Mix de alto rendimiento y el miRCURY Probe Universal Reverse Primer. En combinación con un miRCURY LNA miRNA Probe Assay o un miRCURY LNA miRNA Probe PCR Panel, la química permite la detección de miARN mediante real-time PCR cuantitativa.

miRCURY LNA miRNA Probe Assays

Estos ensayos de cebadores y sondas utilizan sondas de hidrólisis específicas de miARN y cebadores directos específicos de miARN diseñados para detectar los miARN maduros que utilizan la información de secuencias más actualizada de miRBase 22. El miRCURY Probe Universal Reverse Primer se incluye en el miRCURY Probe PCR Kit.

miRCURY LNA miRNA Probe PCR Panels

Placas de panel de PCR listas para usar, prediseñadas y de un único uso para perfilar con rapidez miARN maduros centrándose en el miARNoma, vías específicas, determinados tipos de muestras como suero/plasma o en un panel personalizado diseñado por el usuario.

Centro de análisis de datos GeneGlobe

Esta herramienta de análisis complementaria basada en la web le guía paso a paso mediante un asistente sencillo a través de la normalización y el análisis de sus datos y genera cifras listas para la publicación.

El primer paso, la reacción de transcripción inversa es una reacción fácil de realizar de un único tubo. El ARN total, incluido el miARN, se utiliza como material de inicio y el ADNc resultante se emplea en la amplificación de real-time PCR con cebadores y sonda de hidrólisis mejorados con LNA para detectar los miARN maduros. Esto permite una cuantificación y perfilación de miARN sencillas y accesibles para cualquier laboratorio con un termociclador de real-time PCR.

Los miRCURY LNA miRNA Custom Probe Assays se utilizan como parte del miRCURY LNA miRNA Probe PCR System para:

• Detección, creación de perfiles y cuantificación de la expresión de miARN
• Desarrollo, cribado e identificación de biomarcadores de miARN
• Regulación de miARN y análisis de trayectoria
• Detección de miARN en tipos de muestras complejas y muestras con bajos niveles de expresión de miARN (por ejemplo, exosomas, suero, plasma, orina o secciones de FFPE)
• Detección de snoRNA
• Validación de la secuenciación de miARN