¿Qué puede hacer con las PCR digitales?
Tanto si manipula muestras valiosas como si analiza mutaciones raras o estudia muestras cargadas de inhibidores, la dPCR basada en nanoplacas ofrece datos precisos y reproducibles. El flujo de trabajo rápido y automatizado reduce sustancialmente la variabilidad y mejora la coherencia, al tiempo que es tan sencillo que requiere muy poca formación para dominarlo.
Las PCR digitales, y en concreto la dPCR basada en nanoplacas de QIAcuity está revolucionando los proyectos de investigación al modificar en esencia las preguntas que se pueden plantear y resolver. Este método da impulso a las aplicaciones que antiguamente se veían obstaculizadas por las limitaciones de las qPCR y otras tecnologías de dPCR. Descubra a continuación lo que esta tecnología puede hacer por una aplicación concreta.
Detección de mutaciones raras
La detección de mutaciones raras (rare mutation detection, RMD) hace referencia a la detección de variantes de secuenciación que están presentes en cantidades bajas en un grupo de moléculas nativas de fondo (menos de 1 % o incluso 0,1 %). Por ello, para detectar y cuantificar eventos poco frecuentes, como mutaciones puntuales o polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNP), se requiere un método sensible, preciso y exacto. El reto principal es diferenciar entre dos secuencias muy similares, una de las cuales es mucho más abundante que la otra.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección de mutaciones raras
- Capacidad para cargar un gran volumen de reacción de entrada en 26 000 particiones, lo que aumenta sustancialmente las posibilidades de encontrar una diana poco común
- Multiplexado para secuenciación mutante y nativa para detectar fracciones bajas de moléculas mutantes raras frente a un fondo nativo abundante
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Análisis de variación en el número de copias
Los análisis de variación en el número de copias (CNV) determinan el número de copias de un gen en concreto en el genoma de un individuo. Se sabe que los genes se dan en dos copias por genoma. Sin embargo, estos genes pueden aparecer en una frecuencia mayor, en algunos casos. La amplificación génica (que activa los oncogenes) y la eliminación (que desactiva los genes supresores de tumores) son alteraciones del número de copias (CNA) importantes que afectan a los genes relacionados con el cáncer, además de los cambios genómicos como las mutaciones, translocaciones e inversiones. La mayor parte de los genes relacionados con el cáncer y a los que les afectan las CNA se han definido como genes críticos de las vías de detección del cáncer que tienen que ver con la carcinogénesis y el avance de la enfermedad. Las CNV son una fuente fundamental de diversidad genética (eliminación o duplicación de un locus) y posibilitan el estudio de los genes asociado a las enfermedades autoinmunitarias y neurológicas más frecuentes, los trastornos genéticos y las respuestas adversas a fármacos.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para los análisis CNV
- Detección de cambios inferiores a 1,2 en las CNV, con resultados en unas 2 horas
- Mejora del nivel económico y de rendimiento del análisis dPCR CNV con la Nanoplate 8.5K o capacidades de multiplexado o discriminación más fina de estados consecutivos del número de copias con la Nanoplate 26K
- Cálculo automático de CNV con QIAcuity Software Suite y posibilidad de diseñar ensayos personalizados
Biopsia líquida
Una biopsia líquida, también conocida como biopsia de fluidos o biopsia en fase de fluido, es el muestreo y análisis de un tejido biológico que no es sólido (por lo general, sangre). Se utiliza fundamentalmente como herramienta de diagnóstico y monitorización en enfermedades como el cáncer. La biopsia líquida es menos invasiva para el donante en comparación con la biopsia de tejidos. Cuando las células tumorales mueren, liberan ADNtc a la sangre. Las mutaciones del cáncer en el ADNtc reflejan lo que se detecta en las biopsias tumorales tradicionales, por lo que pueden emplearse como biomarcadores para llevar a cabo un seguimiento de la enfermedad. El mayor problema se debe a la baja concentración de ADNtc de las células tumorales de la sangre. El método de referencia ha sido usar la NGS, la pirosecuenciación o la real-time qPCR, pero el gran problema de estos métodos es su baja condición en cuanto al límite de detección (LOD). La pirosecuenciación de tejido tumoral se encuentra alrededor del 10 %, las técnicas de NGS se encuentran entre 1-5 % mientras que las qPCR pueden detectar cantidades del 1 %. Esto supone un problema para la reincidencia durante la monitorización de enfermedad residual en el donante, por las limitaciones en los niveles de detección.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para el análisis de biopsia líquida
- Cargue hasta 28 µl de muestra para aumentar el LOD y minimizar el error que supone el muestreo insuficiente con QIAcuity Nanoplate 26K: le permite generar más puntos de datos para asegurar pequeños cambios en la expresión o para el seguimiento de la enfermedad residual.
- Detección de mutaciones ultra raras de hasta un 0,01 % de frecuencia alélica variante
- Manipule más muestras sin procesar, como sangre total y orina, ya que la medición por dPCR no se ve afectada por la eficacia de la amplificación
Detección de microbios
La creciente prevalencia de enfermedades infecciosas y brotes epidémicos destaca la necesidad de mejorar la detección y el análisis de microbios, en particular de patógenos. La combinación de velocidad, alta sensibilidad, precisión y cuantificación absoluta es esencial para la detección de microrganismos patógenos y el análisis de microbiomas en el sector de la salud pública y la epidemiología. La PCR digital, como método rápido, sensible y preciso, es muy beneficiosa para identificar, detectar, caracterizar y monitorizar cambios en patógenos y microbiomas. Las áreas de aplicación de la dPCR en detección microbiana abarcan desde microrganismos patógenos en los alimentos, resistencia a los fármacos, investigación de microrganismos patógenos, investigación de genes de resistencia a los antimicrobianos y análisis de relaciones entre virus/bacterias y anfitriones.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección microbiana
- Cuantificación precisa y absoluta de material microbiano incluso a partir de muestras complejas o con altos niveles de inhibidores
- Mayores volúmenes de muestra (hasta 28 µl) con Nanoplate 26K para aumentar la sensibilidad y detectar objetivos por debajo de los límites de detección de otros ensayos comerciales
- Posibilidad de multiplexar hasta cinco ensayos con una selección de ensayos diseñados a medida o más de 700 ensayos incluidos en el catálogo para dianas microbianas (bacterianas, víricas, factores de virulencia, genes metabólicos auxiliares, etc.)
Cuantificación de carga vírica
Las pruebas de carga vírica miden la cantidad de un virus específico en una muestra biológica. Los resultados se indican como el número de copias del ARN vírico por mililitro de muestra. Las pruebas de carga vírica se utilizan para diagnosticar infecciones víricas agudas, proporcionar orientación en la elección de tratamientos y supervisar la respuesta a los tratamientos médicos.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección de genes de virulencia
- Detecte genes de baja abundancia con la Nanoplate 26K, que permite generar mayor número de particiones por muestra con un volumen de carga de muestra más elevado
- Capacidad para analizar objetivos tanto microbianos como víricos, con detección altamente específica únicamente de la secuencia de interés
- Análisis preciso y eficaz mediante el multiplexado de hasta cinco dianas en una reacción
Terapia génica y celular
La PCR digital habilita una gama de aplicaciones de terapia génica, incluido el título del genoma del vector del virus adenoasociado, la medición del número de copias de vector lentivírico y el desarrollo y la fabricación de terapias de células T con receptores quiméricos de antígenos (Chimeric Antigen Receptor, CAR). Esto es fundamental en el desarrollo de terapias génicas y celulares eficaces y reproducibles al tiempo que se garantiza la seguridad del paciente.
Medición del título viral
Descubra cómo el QIAcuity dPCR puede generar el mismo nivel de exactitud y precisión en la cuantificación de la concentración vírica que el método de ddPCR tradicional con una velocidad mayor y un rendimiento y escalabilidad más elevados en general. Descubra un flujo de trabajo completo, desde la lisis de vectores virales hasta la cuantificación del ADN residual, pasando por la titulación genómica del vector y la determinación de la integridad genómica, con una precisión, reproducibilidad y velocidad superiores.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la titulación de AAV
- Determinación consistente y sólida del título final gracias a la eficiente lisis de la cápside y a la eliminación del ADN residual con nuestros kits especializados
- Reducción de errores y fácil aplicación con un protocolo con un número mínimo de pasos manuales y solo 10 minutos de tiempo práctico
- Mayor precisión y flexibilidad gracias al multiplexado con hasta 10 ensayos de diana única con diferentes combinaciones de colorantes; opción de ampliar la capacidad a 5 multiplexados con ensayos de genes de interés (GOI)
- Evaluación precisa de la integridad del genoma utilizando hasta 5 dianas simultáneamente gracias a nuestra avanzada función de software QIAcuity
Cuantificación de ADN residual de célula huésped
El proceso de cuantificación de ADN residual de célula huésped se lleva a cabo durante los procesos de los productos biofarmacéuticos. Los niveles aceptables se determinan según las agencias regulatorias, como la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. y la Organización Mundial de la Salud. Los kits de cuantificación de ADN residual digitales son perfectos para la cuantificación de alta precisión de HCD en bioprocesos complejos. Entre las células huésped utilizadas habitualmente durante el desarrollo de terapias génicas, proteínas terapéuticas y otros productos bioterapéuticos se encuentran las células de riñón embrionario humano 293 (HEK293), ovario de hámster chino (CHO) y E. coli.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la cuantificación del ADN residual de la célula huésped
- Fácil configuración y detección del ADN de la célula huésped gracias a una mezcla maestra previamente mezclada y a un control positivo/interno.
- Detección precisa del ADN residual de E. coli, CHO y HEK293 hasta los femtogramos bajos, incluso en presencia de contaminantes e inhibidores de la PCR
- Los ensayos multicopia específicos para cada especie garantizan que los resultados no se vean afectados por el nivel de fragmentación del ADNres
- Validación de la precisión de la cuantificación o posibilidad de realizar estudios puente utilizando los estándares verificados por dPCR
Detección de micoplasma
Los micoplasmas son contaminantes de los productos biológicos derivados de líneas celulares en la industria biofarmacéutica. Los micoplasmas pueden aparecer en los cultivos celulares como resultado de la contaminación de las propias líneas celulares de origen (sustratos celulares) o por la introducción accidental de micoplasmas durante la producción. Existen múltiples directrices sobre riesgos de contaminación y documentos técnicos sobre seguridad frente a micoplasmas en la fabricación de productos biológicos.
La PCR digital puede utilizarse para detectar la contaminación en cultivos celulares y otros productos biológicos derivados de cultivos celulares. Por ejemplo, el QIAcuity Mycoplasma Quant Kit es un kit de RT-dPCR que detecta ARNr y ADN, lo que aporta una alta sensibilidad al método. Un control interno de amplificación evita falsos negativos provocados por inhibidores de la PCR, una extracción inadecuada del ARN o una reacción de RT incorrecta. El ensayo basado en sondas puede cuantificar y detectar 127 especies diferentes de micoplasmas.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección de micoplasmas
- Conforme: Flujo de trabajo NAT (técnica de ácidos nucleicos) para pruebas de micoplasma que se ajusta a los requisitos de las farmacopeas europea, estadounidense y japonesa.
- Rápido: No es necesario el cultivo de micoplasmas, que requiere mucho tiempo
- Sensible: La detección de ARNr permite una mayor sensibilidad que el uso exclusivo de ADN debido a las múltiples copias presentes en una sola célula bacteriana (detección de <10 UFC/mL). El ensayo sigue siendo capaz de detectar ADN si se omite el paso RT, lo que permite un alto grado de flexibilidad.
- Prevalidado: El flujo de trabajo se ha probado exhaustivamente como parte de un informe de validación completo que puede reducir sus propios esfuerzos de validación
- Diez kits de UFC estándar de micoplasma para validación interna o como control positivo sin introducir micoplasma vital
Análisis de expresión génica
El perfil de expresión génica compara de manera simultánea los niveles de expresión de varios genes entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden definir la base molecular de las diferencias fenotípicas y seleccionar los genes diana para estudios de mayor profundidad. El perfil de expresión génica proporciona una información muy valiosa en la función de expresión génica diferencial en estados biológicos normales y enfermedades.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la cuantificación de la expresión génica
- Detecte pequeños cambios, especialmente modelos de baja cantidad
- Valide los resultados con una concentración absoluta y una abundancia inferior al 1 % según la cantidad de muestra que introduzca.
- Logre una alta precisión y un alto rango dinámico de log5 con Nanoplate 26K o realice series más rentables con reacciones de 12 µl y opciones de alto rendimiento para dianas expresadas de manera «similar» (hasta aproximadamente 4 veces el cambio de expresión) en Nanoplate 8.5K.
Análisis de expresión de miARN
Los perfiles de expresión de microARN (miARN) comparan de manera simultánea los niveles de expresión de varios miARN o miARN únicos entre dos o más muestras. Gracias a estos análisis, los científicos pueden identificar y cuantificar el miARN como biomarcador en enfermedades como el cáncer. Proporciona información muy valiosa sobre la función de la expresión de miARN en estados biológicos normales y enfermedades.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para el análisis de expresión de miARN
- Discriminación de diferencias de un solo nucleótido en miARN estrechamente relacionados por secuencia gracias a la alta especificidad de la dPCR
- Cuantificación absoluta de cambios sutiles en la expresión de miARN, especialmente en modelos de baja cantidad.
Pruebas de alimentos
Los ensayos de PCR digital multiplexada tienen un amplio abanico de aplicaciones en la industria alimentaria, como el control reglamentario, la garantía de calidad, las pruebas de GMO, la detección de alteraciones alimentarias y la vigilancia de enfermedades de transmisión alimentaria. Estos ensayos pueden identificar especies animales y rastrear el origen de productos cárnicos, como distinguir entre cerdo, camello, oveja, burro, cabra, vaca y pollo en una sola reacción. También se utilizan para cuantificar los transgenes en las pruebas de GMO, con estudios que han demostrado una mayor sensibilidad y repetibilidad en comparación con la qPCR. Para detectar la adulteración alimentaria, los ensayos dPCR pueden identificar ingredientes de origen animal en productos vegetarianos o veganos mediante marcadores específicos de ADN mitocondrial y cloroplástico. Además, la dPCR es eficaz en la detección simultánea de múltiples patógenos microbianos, como E. coli, L. monocytogenes, S. aureus y S. enterica, lo que garantiza la seguridad y la calidad de los alimentos.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para pruebas de alimentos
- Ideal para muestras de matrices complejas gracias al multiplexado y a la capacidad de la dPCR para minimizar el efecto de las eficiencias de amplificación gracias a las diferencias de matriz entre el material de referencia y las muestras
- Posibilidades de alto rendimiento gracias al multiplexado de hasta cinco canales y a un sistema de ocho placas
- Detección fiable de eventos de GMO poco frecuentes debido al bajo ruido de fondo gracias a la generación de particiones
Análisis de célula única
A diferencia de los métodos tradicionales de análisis de poblaciones celulares en masa, el análisis de células individuales permite obtener datos a nivel de células individuales, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la heterogeneidad celular, las funciones biológicas, los procesos y los mecanismos de las enfermedades. Los métodos utilizados habitualmente para el análisis de células individuales, como la PCR, la qPCR o la secuenciación de última generación (NGS), carecen a veces de la sensibilidad necesaria para detectar la diana de interés.
La PCR digital es una opción cada vez más utilizada para el análisis unicelular, gracias a plataformas de dPCR rentables, intuitivas y precisas que ofrecen un alto rendimiento, una gran sensibilidad de detección y precisión.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para el análisis de células individuales
- Alta precisión con particiones físicas más estables que las gotas
- La detección basada en sondas permite multiplexar hasta cinco dianas en una única reacción dPCR con una optimización mínima.
- Los resultados precisos permiten analizar dianas de baja abundancia y dianas multicopia a nivel de células individuales
Detección de edición genómica (CRISPR-Cas9)
Las nucleasas como las proteínas con dedos de zinc (ZFN), el efector similar al activador de transcripción (TALEN) y las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas de forma regular y agrupadas (CRISPR) se utilizan para editar los genomas de cualquier célula. Estas nucleasas producen ruptura en el ADN de doble cadena (double-strand breaks, DSB) específico de sitio, que se pueden reparar mediante recombinaciones no homólogas con tendencia a error (NHEJ) (mutación de punto preciso/modelo de donante) o mediante rutas de reparación dirigida por homología (homology-directed repair, HDR) (deleción/inDel/inserción) que generan una mutagénesis dirigida. Como resultado, se desarrolla una población mixta de células con errores de inDel heterogéneos y frecuencias de edición alélica variables. Después, se miden las frecuencias de edición de genomas en el punto deseado. Las líneas celulares clonales aíslan células individuales, donde luego son analizadas para verificar el evento de edición del genoma.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección de ediciones genómicas (CRISPR-Cas9)
- Elevado grado de sensibilidad que posibilita la detección de eventos de edición presentes a frecuencias superiores al 0,5 %
- Cuantificación absoluta de eventos de edición a partir de solo 5 ng de ADNg total
- Capacidad para distinguir entre ediciones homocigóticas y heterocigóticas en poblaciones clonales
Cuantificación de genotecas de NGS
La cuantificación de genotecas de secuenciación de última generación es un paso esencial para utilizar las celdas de flujo con la máxima eficacia. Está demostrado que sobrecargar o infracargar una genoteca de NGS tras una cuantificación inexacta afecta negativamente a la producción y la calidad de los datos. El uso de la PCR digital para determinar la concentración absoluta de un conjunto de genotecas de NGS puede ser muy beneficioso para obtener un rendimiento óptimo y reducir el coste por muestra.
Ventajas del uso de la PCR digital basada en nanoplacas para la cuantificación de genotecas de NGS
- Cuantificación absoluta de fragmentos de genotecas amplificables sin sesgo de amplificación y sin sesgo estándar con resultados en 2 horas, adecuado para pruebas rutinarias
- Alta reproducibilidad y uniformidad superior para la agrupación de genotecas con cobertura de todos los tipos de genotecas Illumina con un solo ensayo
Cuantificación e interacción de proteínas
La tecnología de acoplamiento de interacciones de proteínas (Protein Interaction Coupling, PICO) de Actome se beneficia del QIAcuity Digital PCR System para ofrecer un enfoque muy versátil y sensible para detectar y cuantificar proteínas únicas e interacciones proteicas. La tecnología PICO traduce el estado de proteínas complejas en códigos de barras de ADN que pueden amplificarse y detectarse mediante dPCR. Esto es especialmente útil al investigar rutas celulares, buscar biomarcadores proteicos, desarrollar ensayos nuevos para investigación farmacéutica o hacer análisis multi-omics.
Ventajas de la dPCR basada en nanoplacas para la detección de proteínas
- La única tecnología del mercado para cuantificar proteínas mediante dPCR
- Detección de proteínas, interacción proteína-proteína y modificaciones postraduccionales a nivel unicelular
