QuantiNova Pathogen +IC Kit

• Vorab optimierte interne Kontrollen ohne zusätzliche Kosten
• 4-Plex-(RT-)PCR für den Nachweis sowohl von pathogenen Zielen als auch von internen Kontrollen
• Einzigartiges zweiphasiges Hot-Start-Verfahren für eine bequeme Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur
• Stabile RT ist im Master-Mix enthalten und sorgt für ein anwenderfreundliches Protokoll
• Visuelle Pipettierkontrolle zur Minimierung von Fehlern

Das QuantiNova Pathogen +IC Kit ist für den sensitiven, schnellen Real-time-(RT-)PCR-Nachweis von pathogenen Nukleinsäuren unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden ausgelegt. Das Kit enthält Reagenzien für den 4-Plex-Real-time-Nachweis von benutzerdefinierten pathogenen Zielen (z. B. Viren, Bakterien, Pilzen usw.) sowie die QuantiNova Internal Control (IC) RNA oder DNA. Sowohl die internen Kontrollen als auch der Assay können als Extraktions- oder Amplifikationskontrollen verwendet werden, sodass auch negative Ergebnisse korrekt interpretiert werden können. Darüber hinaus bietet das ultraschnelle, gebrauchsfertige Kit eine bequeme Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur für einen optimierten, automatisierten Workflow sowie eine visuelle Pipettierkontrolle zur Erhöhung der Handhabungs- und Sicherheitsstandards. Der Master-Mix kann bequem bei 2–8 °C gelagert werden.

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Das QuantiNova Pathogen +IC Kit ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis viraler RNA- oder DNA-Ziele und die QuantiNova interne Kontrolle (IC) verfügt über einen breiten linearen Bereich, ohne beim Multiplexing an Sensitivität zu verlieren. Das Protokoll wurde für die Durchführung ultraschneller Zyklusexperimente entwickelt, die auf den meisten Thermocyclern eine ausgezeichnete Zuverlässigkeit bieten. Die kombinierte Amplifikation von pathogenen Zielen und der IC-RNA oder -DNA sorgt für mehr Sicherheit im Prozess, da die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse gewährleistet ist. Die im Kit enthaltene IC kann zur Überwachung des Prozesses zur Nukleinsäureaufreinigung und/oder -amplifikation verwendet werden, während die visuelle Pipettierkontrolle eine visuelle Kontrolle nach der manuellen oder robotergestützten Pipettierung ermöglicht (siehe Abbildung  Genaue Reaktionseinrichtung dank integrierter Pipettierkontrolle). Mit dem einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Verfahren ist es möglich, eine manuelle oder automatisierte Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur durchzuführen, ohne die Leistung zu beeinträchtigen (siehe Abbildung  Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus). Das QuantiNova Pathogen +IC Kit ist selbst in Anwesenheit von Inhibitoren robust und ermöglicht die Verwendung degenerierter Primer/Sonden. Das Kit bietet ultraschnelle, durch In-Prozess-Kontrollen abgesicherte Multiplex-qPCR und erhöht die Effizienz und Zuverlässigkeit des Workflows.

Um eine höhere Prozesssicherheit durch die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse zu ermöglichen, enthält jedes QuantiNova Pathogen +IC Kit Reagenzien für den Real-time-Multiplex-Nachweis von benutzerdefinierten pathogenen Zielen mit internen Kontrollen. Die Amplifikation von Ziel- und Kontrollgenen in derselben Reaktion erhöht die Zuverlässigkeit, indem Fehler in der Handhabung auf ein Minimum reduziert werden. Die im Kit enthaltene interne Kontrolle kann verwendet werden, um die Qualität der Amplifikation zu überprüfen (z. B. Ausschluss von PCR-Inhibitoren). Sie kann aber auch vor der Nukleinsäureaufreinigung zur Probe zugegeben werden, um sowohl die Effizienz des Aufreinigungsprozesses als auch die PCR- oder RT-PCR-Amplifikation zu kontrollieren. Die Real-time-PCR und die Ein-Schritt-RT-PCR können gleichzeitig mit demselben Protokoll durchgeführt werden. Das Kit nutzt außerdem ein zweiphasiges Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung  Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus). Dazu gehört die thermische Aktivierung sowohl der reversen Transkriptase des HotStaRT-Scripts bei 50 °C als auch der PCR-Polymerase bei 95 °C. Bei niedrigen Temperaturen bildet das HotStaRT-Script einen Komplex mit einem RT-Blocker-Molekül, was zur Inaktivierung führt. Der Komplex dissoziiert bei 50 °C und das aktive Enzym des HotStaRT-Scripts wird freigesetzt. Die QuantiNova DNA Polymerase wird durch den QuantiNova Antibody und QuantiNova Guard, einen neuartigen komplexstabilisierenden Zusatzstoff, in einem inaktiven Zustand gehalten. Dies verbessert die Stringenz des Hot-Start-Verfahrens und verhindert die Extension von unspezifisch hybridisierten Primern und Primer-Dimeren. Innerhalb von 2 Minuten nach Temperaturerhöhung auf 95 °C werden der QuantiNova Antibody und QuantiNova Guard denaturiert und die QuantiNova DNA Polymerase wird aktiviert, was die PCR-Amplifikation ermöglicht. Dieses einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren sorgt dafür, dass die Reaktion mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stabil bleibt, und verhindert so die Entstehung von Artefakten. Außerdem wird dadurch die automatisierte Reaktionseinrichtung erleichtert.
Darüber hinaus enthält der mit dem Kit gelieferte Master-Mix einen inerten blauen Farbstoff, der die reverse Transkription oder Real-time-PCR nicht stört, aber die Sichtbarkeit im Röhrchen oder in der Kavität erhöht. Der QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer enthält einen inerten gelben Farbstoff. Wenn die mit dem QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer verdünnte Template-Nukleinsäure dem Master-Mix zugegeben wird, wechselt die Farbe der Lösung von Blau nach Grün und gibt so einen visuellen Hinweis auf die korrekte Pipettierung und Reaktionseinrichtung (siehe Abbildung  Genaue Reaktionseinrichtung dank integrierter Pipettierkontrolle). Der Master-Mix enthält eine ausgewogene Kombination aus K⁺- und NH₄⁺-Ionen sowie den einzigartigen synthetischen Faktor MP, die zusammen eine stabile und effiziente Hybridisierung von Primern und Sonden an das Nukleinsäure-Template fördern und dadurch auch bei Multiplex-Reaktionen eine hohe PCR-Effizienz ermöglichen (siehe Abbildung  Förderung einer stabilen und effizienten Hybridisierung durch einen einzigartigen Multiplex-PCR-Puffer). Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält Q-Bond, das die Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt (siehe Abbildung  Mechanismus der schnellen Zyklen während der Hybridisierung). Der im Kit enthaltene QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer stabilisiert die RNA- und DNA-Standards während der Verdünnung und Reaktionseinrichtung und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen. Der Master-Mix kann bei 2–8 °C bis zu 12 Monate lang gelagert werden, und die Reaktion ist bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde lang stabil, was für automatisierte Verfahren praktisch ist.