QuantiNova-RT-PCR-Kits

• Einzigartiges zweiphasiges Hot-Start-Verfahren für die Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur
• Visuelle Pipettierkontrolle zur Minimierung von Pipettierfehlern
• Interne Kontrolle zur In-Prozess-Bestätigung einer erfolgreichen RT-PCR
• Genaue Quantifizierung über mehrere logarithmische Template-Größenordnungen
• Sensitiver Nachweis von bis zu 5 Zielen in 1 Röhrchen

QuantiNova-RT-PCR-Kits (Real-time-RT-PCR-Kits) ermöglichen die sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mittels Real-time-PCR in einem Schritt unter Verwendung von SYBR Green I oder sequenzspezifischen Sonden. Eine Kombination aus verschiedenen integrierten Sicherheitsfunktionen beseitigt Variablen und verhindert Artefakte, wodurch eine zuverlässige Erstellung von Genexpressionsprofilen gewährleistet wird. Die Kombination aus dem einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Mechanismus und dem PCR-Puffersystem im gebrauchsfertigen Master-Mix ermöglicht die Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur und gewährleistet eine hoch sensitive qRT-PCR auf jedem Real-time-Thermocycler. Die optionale QuantiNova Internal Control RNA kann verwendet werden, um die erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler bei der Assayeinrichtung und das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen. Zur Bestätigung der korrekten Pipettierung kann darüber hinaus die visuelle Pipettierkontrolle verwendet werden. Die integrierte gDNA-Reduktion im QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren verhindert eine überhöhte Quantifizierung von Transkripten durch die Verschleppung von genomischer DNA.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit ermöglicht die schnelle und zuverlässige Quantifizierung von bis zu 5 RNA-Zielen in einem einzelnen Röhrchen mittels Real-time-PCR im Multiplex-Format. Unsere Q-Bond-Technologie und ein optimierter Master-Mix ermöglichen eine ultraschnelle Real-time-RT-PCR im Multiplex-Format innerhalb von 1 Stunde. Die Kombination eines einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Verfahrens mit unserem Multiplex-PCR-Puffersystem gewährleistet eine hoch sensitive qRT-PCR auf einem beliebigen Real-time-Thermocycler, und zwar ganz ohne Optimierung und mit der Möglichkeit zur automatisierten Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur. Das Kit enthält auch Protokolle für extrahierte RNA und die direkte Amplifikation aus kultivierten Zellen, und zwar ab einer einzelnen Zelle. Die optionale QuantiNova Internal Control RNA kann verwendet werden, um die erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen. Die visuelle Pipettierkontrolle dagegen dient zur Bestätigung einer korrekten Pipettierung.

Integrierte visuelle Anzeige für eine genaue Reaktionseinrichtung

Der mit den QuantiNova-RT-PCR-Kits mitgelieferte Master-Mix enthält einen inerten blauen Farbstoff, der die Real-time-PCR nicht stört, aber die Sichtbarkeit im Röhrchen oder in der Kavität erhöht. Der QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer enthält einen inerten gelben Farbstoff. Wenn die Template-Nukleinsäure mit QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer verdünnt und dem Master-Mix zugegeben wird, wechselt die Farbe der Lösung von Blau nach Grün (siehe Abbildung “ Genaue Reaktionseinrichtung dank integrierter Pipettierkontrolle”). Dadurch erhalten Sie eine visuelle Bestätigung, dass jede Reaktion korrekt eingerichtet wurde.

QuantiNova SYBR Green und QuantiNova Probe RT-PCR Kits

QuantiNova SYBR Green und QuantiNova Probe RT-PCR Kits nutzen ein zweiphasiges Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung “ Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus”). Dazu gehört die thermische Aktivierung sowohl der reversen Transkriptase des HotStaRT-Scripts bei 50 °C (SYBR-Green- und Multiplex-Kits) oder 45 °C (Sonden-Kit) als auch der PCR-Polymerase bei 95 °C. Bei niedrigen Temperaturen bildet das HotStaRT-Script einen Komplex mit einem RT-Blocker-Molekül, was zur Inaktivierung führt. Bei 50 °C (SYBR-Green- und Multiplex-Kits) oder 45 °C (Sonden-Kit) dissoziiert der Komplex und das aktive Enzym des HotStaRT-Scripts wird freigesetzt. Die QuantiNova DNA Polymerase wird durch den QuantiNova Antibody und QuantiNova Guard, einen neuartigen komplexstabilisierenden Zusatzstoff, in einem inaktiven Zustand gehalten. Dies verbessert die Stringenz des Hot-Start-Verfahrens und verhindert die Extension von unspezifisch hybridisierten Primern und Primer-Dimeren. Innerhalb von 2 Minuten (SYBR-Green- und Multiplex-Kits) bzw. 5 Minuten (Sonden-Kit) nach Temperaturerhöhung auf 95 °C werden der QuantiNova Antibody und QuantiNova Guard denaturiert und die QuantiNova DNA Polymerase wird aktiviert, was die PCR-Amplifikation ermöglicht. Dieses einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren sorgt dafür, dass die eingerichtete Reaktion bei Raumtemperatur mindestens 2 Stunde lang stabil bleibt (siehe Abbildung “ Bequeme Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur ohne Leistungseinbußen”) und verhindert so die Entstehung von Artefakten. Außerdem wird dadurch die automatisierte Reaktionseinrichtung erleichtert.

Die QuantiNova DNA Polymerase und die einzigartige Zusammensetzung des RT-PCR-Puffers ermöglichen eine sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich, die auf jedem handelsüblichen Thermocycler durchgeführt werden können (siehe Abbildung “ Genaue Quantifizierung bei sehr hohen oder sehr niedrigen Ausgangsmengen”).

Der gDNA-Reduktionsschritt in QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren minimiert die durch Verschleppung genomischer DNA verursachte Fehlquantifizierung. Die Reduktion der genomischen DNA ist von entscheidender Bedeutung für genaue Genexpressionsergebnisse und macht die Entwicklung RNA-spezifischer Primer oder Sonden überflüssig. Mit der integrierten gDNA-Reduktion (siehe Abbildung “ Erhöhte Zuverlässigkeit der Genexpressionsergebnisse durch gDNA-Reduktion”) werden Zeit und Kosten gespart, da ein separater DNase-Verdau während oder nach der Aufreinigung der RNA-Proben nicht erforderlich ist.

Die neu entwickelte interne Kontrolle ist ein definiertes Transkript (RNA-Molekül), das einfach zu Ihren Proben zugegeben und in cDNA transkribiert werden kann. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler bei der Assayeinrichtung oder das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen. Da sich die interne Kontrolle ähnlich verhält wie echte Transkripte (siehe Abbildung “ Zuverlässige Überwachung der RT-PCR-Inhibition”), kann sie zur Bestätigung der erfolgreichen reversen Transkription und Amplifikation verwendet werden. Die Duplex-Fähigkeit ermöglicht außerdem die Einbindung der internen Kontrolle oder eines Referenzgens zum direkten Vergleich mit dem Zielgen.

Die QuantiNova DNA Polymerase und die einzigartige Zusammensetzung des RT-PCR-Puffers ermöglichen eine sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich, die auf jedem handelsüblichen Thermocycler durchgeführt werden können.

QuantiNova Multiplex RT-PCR Kits

Der im QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit enthaltene spezielle Master-Mix ermöglicht eine einfache Einrichtung von Multiplex-Reaktionen und gewährleistet, dass die Ergebnisse mit denen einer Singleplex-RT-PCR vergleichbar sind. Der hochkonzentrierte 4x Master-Mix ermöglicht den Einsatz von bis zu 800 ng Template und bietet eine herausragende Sensitivität, und zwar bis hin zu 5-Plex-Reaktionen.

Das Kit kann kleine Unterschiede in der Menge des Templates eindeutig unterscheiden und ermöglicht eine genaue Quantifizierung von Zielen mit sehr unterschiedlicher Abundanz (siehe Abbildung “ Hoch sensitiver Multiplex-Nachweis von Zielen mit unterschiedlicher Abundanz”). Darüber hinaus steht ein einfaches Protokoll für die direkte Amplifikation aus kultivierten Zellen zur Verfügung, das die RNA-Analyse sogar schon aus einer einzelnen Zelle ermöglicht (siehe Abbildung “ Multiplex-Genexpressionsanalyse an einzelnen Zellen”). Das einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung “ Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus”) gewährleistet eine herausragende Spezifität und ermöglicht eine Reaktionseinrichtung bei Raumtemperatur, die sich besonders gut für automatisierte Verfahren eignet. Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält das Additiv Q-Bond, das die Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt, sodass eine Multiplex-qRT-PCR in etwa einer Stunde möglich ist. Die Integration einer visuellen Pipettierkontrolle erhöht die Sicherheit während des Prozesses, indem menschliche Fehler auf ein Minimum reduziert werden (siehe Abbildung “ Genaue Reaktionseinrichtung dank integrierter Pipettierkontrolle”). Die optionale Internal Control RNA, die zusammen mit den Zielen detektiert werden kann, beseitigt Variationen, die durch Inhibitoren oder andere Faktoren verursacht werden, und ermöglicht die Überwachung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit. Insgesamt erhöht unser ultraschneller und durch In-Prozess-Kontrollen abgesicherter Multiplex-qRT-PCR-Workflow die Effizienz, indem er mehr Erkenntnisse aus begrenztem Probenmaterial gewinnt.

QuantiNova-RT-PCR-Kits enthalten optimierte, gebrauchsfertige Master-Mixe für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von RNA-Zielen mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I oder sequenzspezifischen Sonden. Das QuantiNova Probe RT-PCR Kit ist für die Verwendung mit verschiedenen Arten sequenzspezifischer Sonden ausgelegt, einschließlich Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan- und anderer doppelt markierter Sonden) und Scorpions-Primern. Die Kits enthalten einen einzigartigen PCR-Puffer, der eine ausgewogene Kombination von K⁺- und NH₄⁺-Ionen enthält, die für eine spezifische Primerhybridisierung sorgen und somit eine hohe Spezifität und Sensitivität gewährleisten. Außerdem ermöglicht das HotStaRT-Script die cDNA-Synthese über einen großen Bereich von RNA-Template-Mengen. Die QuantiNova DNA Polymerase sorgt dagegen für ein effizientes Hot-Start-Verfahren, das die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert. Das einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren ermöglicht eine Reaktionseinrichtung, die bei Raumtemperatur bis zu 2 Stunden lang stabil bleibt und somit eine Automatisierung der Einrichtung ermöglicht.

Mit Hilfe der integrierten visuellen Kontrolle können Sie überprüfen, ob das Template der Reaktion zugegeben wurde und somit Pipettierfehler bei der Reaktionseinrichtung vermeiden.

Der Nachweis von Variationen bei der cDNA-Synthese ermöglicht es, die Reproduzierbarkeit Ihrer Ergebnisse zu überprüfen. Die neu entwickelte interne Kontrolle ist ein definiertes Transkript (RNA-Molekül), das bei Bedarf zu Ihren Proben zugegeben und in cDNA transkribiert werden kann. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler bei der Assayeinrichtung und das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen.

Um bei Real-time-RT-PCR-Genexpressionsassays genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, dass nur cDNA amplifiziert und detektiert wird. Störungen durch genomische DNA werden bei den QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren durch den gDNA-Reduktionsschritt verhindert (siehe Abbildung “ Erhöhte Zuverlässigkeit der Genexpressionsergebnisse durch gDNA-Reduktion”). Da ein separater DNase-Verdau während oder nach der Aufreinigung der RNA-Proben nicht erforderlich ist, können Sie Zeit sparen und die Kosten senken. Außerdem müssen keine RNA-spezifischen Primer oder Sonden entwickelt werden.
Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit liefert hoch sensitive und schnelle Ergebnisse über einen breiten dynamischen Bereich sowohl auf standardmäßigen als auch auf schnellen Thermocyclern, und zwar ohne Optimierung. Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält das Additiv Q-Bond, das die Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt. Die Amplifikation von Referenz- und Zielgenen in derselben Reaktion erhöht die Zuverlässigkeit, indem Variationen von Kavität zu Kavität und Handhabungsfehler auf ein Minimum reduziert werden. Zusätzlich ist eine Internal Control RNA für den gleichzeitigen Nachweis enthalten, um eine erfolgreiche reverse Transkription und qPCR zu bestätigen.

Bei den QuantiNova SYBR Green und Probe RT-PCR Kits entfällt die Notwendigkeit, die Reaktionsbedingungen zu optimieren, was mitunter mühsam und zeitaufwändig sein kann. Geben Sie einfach Primer, RNA-Template und RT-Mix zur gebrauchsfertigen RT-PCR oder zum Master-Mix zu und starten Sie die Reaktion. Befolgen Sie das Protokoll im Handbuch des QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kits oder des QuantiNova Probe RT-PCR Kits, um schnelle und zuverlässige Ergebnisse auf jedem Real-time-Thermocycler zu erhalten.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit enthält einen gebrauchsfertigen 4x Master-Mix, sodass die Reaktions- und Zyklusbedingungen nicht mehr optimiert werden müssen. Geben Sie einfach den RT-Mix, bis zu 800 ng Template-RNA und die Primer-Sonden-Sets zum Master-Mix zu und befolgen Sie das Protokoll im Handbuch, um schnelle und zuverlässige Ergebnisse mit jedem Real-time-Thermocycler zu erhalten. Der Referenzfarbstoff ROX wird ebenfalls in einem separaten Röhrchen bereitgestellt, sodass Sie die Konzentration für Ihr jeweiliges Gerät anpassen können. Das Kit bietet außerdem ein einfaches und schnelles Protokoll für die direkte Amplifikation aus kultivierten Zellen. Die empfohlene Ausgangsmenge reicht von 2000 Zellen bis zur einzelnen Zelle, z. B. durch Trennung mittels Reihenverdünnung oder unter Verwendung des QIAscout-Geräts. Bei der QuantiNova Internal Control RNA (QN IC RNA) handelt es sich um eine interne Amplifikationskontrolle, die bei Bedarf verwendet werden kann, um eine erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen. Detektiert wird sie bei Verwendung des QuantiNova IC Probe Assays in Form einer internen Kontrolle mit 200 bp im gelben Kanal auf dem Rotor-Gene Q oder im Kanal des VIC/HEX-Farbstoffs auf anderen Real-time-PCR-Geräten. Alternativ kann sie im roten Kanal des Rotor-Gene Q oder im Kanal des Cy5-Farbstoffs auf anderen Real-time-PCR-Geräten nachgewiesen werden, wenn Sie den QuantiNova IC Probe Assay Red 650 verwenden.

Für einen optimierten Workflow empfehlen wir, die QuantiNova-Kits mit unseren vorkonfigurierten QuantiNova Real-time-PCR-Assays oder -Panels zu kombinieren. Diese ermöglichen eine präzise Quantifizierung von mRNA oder langen, nicht-kodierenden RNA-Transkripten, und zwar unabhängig von ihrer Abundanz. Wählen Sie aus einer breiten Palette an vorkonfigurierten Primer-Sets von Mensch, Maus und Ratte, oder passen Sie Ihre eigenen Assays und Panels mit unseren fortschrittlichen Designtools an.
 
Unsere QuantiNova LNA PCR und QuantiNova LNA Probe PCR Assays beruhen auf der LNA-Technologie, die für eine verbesserte Sensitivität sorgt. Das Ergebnis sind unverfälschte Genexpressionsprofile und wissenschaftliche Erkenntnisse, die schneller verfügbar sind.

Für den Nachweis auf Basis von SYBR-Green bestellen Sie bitte den QuantiNova IC SYBR Green Assay (erhältlich unter der Bezeichnung HS_QIC_2467742 QuantiNova LNA PCR Reference Assay und GeneGlobe-ID: SBH1218551) über unsere GeneGlobe-Plattform.

Hinweis: Der QuantiNova IC SYBR Green Assay war vormals als QuantiTect Primer Assay für den Nachweis von IC-RNA auf SYBR-Basis erhältlich (Kat.-Nr. QT02589307).

QuantiNova SYBR Green und Probe RT-PCR Kits können für die Genexpressionsanalyse von RNA-Zielen auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Dazu gehören der Rotor-Gene Q und Geräte von Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche und Agilent.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit kann für die Multiplex-Genexpressionsanalyse von RNA-Zielen auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Um das Potenzial des Multiplex-Formats voll auszuschöpfen, empfehlen wir die Verwendung eines Geräts mit bis zu 5-Plex-Kapazität, wie z. B. den Rotor-Gene Q.