QuantiNova Pathogen +IC Kit

• Voroptimierte interne Kontrollen ohne zusätzliche Kosten
• 4-Plex-(RT-)PCR zum Nachweis von Erreger-Zielen und interner Kontrolle
• Einzigartiges zweiphasiges Hot-Start-Verfahren für bequemen Reaktionsansatz bei Raumtemperatur
• Stabile RT ist im Master-Mix enthalten und sorgt für ein anwenderfreundliches Protokoll
• Visuelle Pipettierkontrolle zur Minimierung von Fehlern

Das QuantiNova Pathogen +IC Kit wurde für den sensitiven, schnellen Real-time-(RT-)PCR-Nachweis von Pathogen-Nukleinsäuren mit sequenzspezifischen Sonden entwickelt. Das Kit enthält Reagenzien für den 4-Plex-Real-time-Nachweis von benutzerdefinierten Erreger-Zielen (z. B. Viren, Bakterien, Pilzen usw.) sowie die QuantiNova Internal Control (IC) RNA oder DNA. Die internen Kontrollen und der Assay können als Extraktions- oder Amplifikationskontrollen verwendet werden, sodass auch negative Ergebnisse korrekt interpretiert werden können. Darüber hinaus bietet das ultraschnelle, gebrauchsfertige Kit den bequemen Reaktionsansatz bei Raumtemperatur für einen optimierten, automatisierten Workflow sowie eine visuelle Pipettierkontrolle für verbesserte Handhabungs- und Sicherheitsstandards. Der Master-Mix kann bei 2–8 °C gelagert werden.

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Das QuantiNova Pathogen +IC Kit ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis viraler RNA- oder DNA-Ziele und der internen QuantiNova-Kontrolle (IC) über einen breiten linearen Bereich ohne Sensitivitätsverlust in Multiplex-Reaktionen. Das Protokoll wurde entwickelt, um ultraschnelle Cycling-Experimente mit hoher Zuverlässigkeit auf den meisten Thermocyclern durchzuführen. Die kombinierte Amplifikation von Erreger-Zielen und der IC-RNA oder -DNA erhöht die interne Prozesssicherheit, indem sie die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse gewährleistet. Die im Kit enthaltene IC kann zur Überwachung der Nukleinsäureaufreinigungs- und/oder -amplifikationsprozesse verwendet werden, während die visuelle Pipettierkontrolle eine visuelle Kontrolle nach der manuellen oder robotergestützten Pipettierung ermöglicht (siehe Abbildung  Genauer Reaktionsansatz, nachgewiesen durch die integrierte Pipettierkontrolle). Mit dem einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Verfahren ist es möglich, Reaktionen manuell oder automatisiert bei Raumtemperatur anzusetzen, ohne die Leistung zu beeinträchtigen (siehe Abbildung  Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus). Das QuantiNova Pathogen +IC Kit ist selbst in Anwesenheit von Inhibitoren robust und ermöglicht die Verwendung degenerierter Primer/Sonden. Das Kit bietet ultraschnelle, durch In-Prozess-Kontrollen abgesicherte Multiplex-qPCR und erhöht so die Effizienz und Zuverlässigkeit des Workflows.

Um eine höhere Prozesssicherheit durch die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse zu ermöglichen, enthält jedes QuantiNova Pathogen +IC Kit Reagenzien für den Real-time-Multiplex-Nachweis von benutzerdefinierten Erreger-Zielen mit internen Kontrollen. Die Amplifikation von Ziel- und Kontrollgenen in derselben Reaktion erhöht die Zuverlässigkeit, da Handhabungsfehler minimiert werden. Die im Kit enthaltene IC kann verwendet werden, um die Qualität der Amplifikation zu untersuchen (z. B. Ausschluss von PCR-Inhibitoren). Sie kann aber auch vor der Nukleinsäureaufreinigung zur Probe zugegeben werden, um sowohl die Effizienz des Aufreinigungsprozesses als auch die PCR- oder RT-PCR-Amplifikation zu überprüfen. Die Real-time-PCR und die Ein-Schritt-RT-PCR können gleichzeitig mit demselben Protokoll durchgeführt werden. Das Kit nutzt außerdem ein zweiphasiges Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung  Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus). Dazu gehört die thermische Aktivierung der HotStaRT-Script reversen Transkriptase bei 50 °C und der PCR-Polymerase bei 95 °C. Bei niedrigen Temperaturen bildet die HotStaRT-Script einen Komplex mit einem RT-Blocker-Molekül, und wird so inaktiviert. Der Komplex dissoziiert bei 50 °C und setzt das aktive HotStaRT-Script-Enzym frei. Die QuantiNova DNA Polymerase wird durch den QuantiNova Antibody und das QuantiNova Guard, ein neuartiges komplexstabilisierendes Additiv, in einem inaktiven Zustand gehalten. Dies verbessert die Stringenz des Hot-Start-Verfahrens und verhindert die Extension von unspezifisch hybridisierten Primern und Primer-Dimeren. Innerhalb von 2 Minuten nach Temperaturerhöhung auf 95 °C werden der QuantiNova Antibody und das QuantiNova Guard denaturiert und die QuantiNova DNA Polymerase aktiviert, um die PCR-Amplifikation zu ermöglichen. Dieses einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren sorgt dafür, dass der Reaktionsansatz mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stabil bleibt, was die Entstehung von Artefakten verhindert und den automatisierten Reaktionsansatz erleichtert.
Darüber hinaus enthält der mit dem Kit gelieferte Master-Mix einen inerten blauen Farbstoff, der die reverse Transkription oder Real-time-PCR nicht stört, aber die Sichtbarkeit im Röhrchen oder Well erhöht. Der QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer enthält einen inerten gelben Farbstoff. Wenn die mit dem QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer verdünnte Template-Nukleinsäure dem Master-Mix zugegeben wird, ändert sich die Farbe der Lösung von Blau nach Grün, was einen visuellen Hinweis auf das richtige Pipettieren und den korrekten Reaktionsansatz liefert (siehe Abbildung  Genauer Reaktionsansatz, nachgewiesen durch die integrierte Pipettierkontrolle). Der Master-Mix enthält eine ausgewogene Kombination aus K⁺- und NH₄⁺-Ionen sowie den einzigartigen synthetischen Faktor MP, die zusammen eine stabile und effiziente Hybridisierung von Primern und Sonden an das Nukleinsäure-Template fördern und dadurch auch bei Multiplex-Reaktionen eine hohe PCR-Effizienz ermöglichen (siehe Abbildung  Einzigartiger Multiplex-PCR-Puffer fördert stabile und effiziente Hybridisierung). Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält Q-Bond, das die Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt (siehe Abbildung  Schneller Cycling-Mechanismus bei der Hybridisierung). Der im Kit enthaltene QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer stabilisiert die RNA- und DNA-Standards bei Verdünnung und Reaktionsansatz und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren durch Adsorption an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen. Der Master-Mix kann bei 2–8 °C bis zu 12 Monate lang gelagert werden, und die Reaktion ist bei Raumtemperatur mindestens eine Stunde lang stabil, was für automatisierte Verfahren von Vorteil ist.