Cat. No. / ID: 204343
QuantiTect-PCR-Kits (qPCR-Kits) ermöglichen die sensitive Quantifizierung von gDNA- und cDNA-Zielen mittels Real-time-PCR und Zwei-Schritt-RT-PCR unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden oder SYBR Green I. Die Real-time-PCR-Kits ermöglichen außerdem die zuverlässige Quantifizierung von bis zu 5 gDNA- oder 5 cDNA-Zielen in einem einzigen Röhrchen mittels Real-time-PCR im Multiplex-Format oder Zwei-Schritt-RT-PCR. Die Kombination aus Hot-Start und einem einzigartigen PCR-Puffersystem im gebrauchsfertigen Master-Mix gewährleistet eine hoch sensitive qPCR auf jedem Real-time-Thermocycler, ganz ohne Optimierung. Der dNTP-Mix enthält dUTP, was eine optionale Behandlung mit UNG ermöglicht. Die Master-Mixe in den QuantiTect-PCR-Kits können bequem bei 2–8 °C gelagert werden.
Für die Multiplex-PCR mit sequenzspezifischen Sonden sind zwei Kit-Formate erhältlich: das QuantiTect Multiplex PCR Kit für Thermocycler, die ROX-Farbstoff zur Fluoreszenznormalisierung benötigen, und das QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit für alle anderen Thermocycler.
Die HotStarTaq DNA Polymerase, die in den quantitativen QuantiTect-PCR-Kits enthalten ist, erhöht die Spezifität der PCR-Reaktion, da sie im Vergleich zu anderen Polymerasen einen besonders effizienten Hot-Start ermöglicht.
QuantiTect SYBR Green PCR Kits ermöglichen eine spezifische Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich (siehe Abbildung „ Spezifische Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich“). In Kombination mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit und den QuantiTect Primer Assays liefern die QuantiTect SYBR Green PCR Kits sensitive und zuverlässige Ergebnisse (siehe Abbildung „ Spezifische und sensitive Quantifizierung“).
QuantiTect Probe PCR Kits liefern in Kombination mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit sensitive und zuverlässige Ergebnisse (siehe Abbildung „ Hohe Sensitivität und Effizienz sowie ein breiter dynamischer Bereich“). Die einzigartige Zusammensetzung des PCR-Puffers sorgt für eine sensitive Quantifizierung von DNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie für eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich mit den QuantiTect Probe PCR Kits (siehe Abbildung „ Breiter dynamischer Bereich in der Real-time-PCR“).
Der QuantiTect Multiplex PCR Master Mix gewährleistet, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in den entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktionen (siehe Tabelle “Vergleichbare CΤ-Werte (Threshold Cycle) bei Triplex- und Singleplex-PCRs” und Abbildung “ Vergleichbare Ergebnisse bei der 4-Plex-PCR und den entsprechenden Singleplex-PCRs”.
Nachweis der Translokationssequenz t(8;14) (20 Kopien) | Nachweis der GAPDH-cDNA-Sequenz (106 Kopien) | Nachweis der NFKB-cDNA-Sequenz (siehe erste Spalte für die Kopienzahl) | |
---|---|---|---|
Triplex-PCR mit 105 Kopien von NFKB | 34,31 | 20,37 | 21,92 |
Entsprechende Singleplex-PCRs | 34,07 | 20,54 | 21,83 |
Triplex-PCR mit 104 Kopien von NFKB | 34,61 | 20,62 | 25,03 |
Entsprechende Singleplex-PCRs | 34,00 | 20,46 | 25,19 |
Triplex-PCR mit 103 Kopien von NFKB | 35,17 | 19,94 | 28,38 |
Entsprechende Singleplex-PCRs | 34,43 | 20,50 | 28,65 |
Mit den Kits können bereits 10 Kopien eines Zielgens nachgewiesen werden, selbst wenn die Kopienzahl des Referenzgens in derselben Reaktion bis zu 106-fach höher ist (siehe Abbildung „“ Nachweis von 10 Kopien des Zielgens mit einem Überschuss an Referenzgen“ und die entsprechende Tabelle „Erfolgreiche quantitative Triplex-qPCR von Zielen mit geringer und hoher Abundanz“).
Nachweis von CSBG | Nachweis von GAPDH | Nachweis von HSP | |
Template-Mix 1 | 1400 Kopien | 106 Kopien | 2 × 104 Kopien |
---|---|---|---|
CT-Werte für Triplex-PCR | 27,73 | 18,69 | 23,59 |
CT-Werte für Singleplex-PCRs | 27,08 | 18,89 | 23,52 |
Template-Mix 2 | 140 Kopien | 106 Kopien | 2 × 103 Kopien |
CT-Werte für Triplex-PCR | 31,11 | 19,00 | 27,05 |
CT-Werte für Singleplex-PCRs | 30,66 | 18,61 | 26,97 |
Template-Mix 3 | 14 Kopien | 106 Kopien | 2 × 102 Kopien |
CT-Werte für Triplex-PCR | 34,74 | 18,98 | 30,71 |
CT-Werte für Singleplex-PCRs | 33,84 | 19,01 | 30,38 |
QuantiTect SYBR Green PCR Kits enthalten einen optimierten, gebrauchsfertigen Master-Mix für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von cDNA-Zielen unter Verwendung von SYBR Green I (siehe Tabelle “Komponenten des 2x QuantiTect SYBR Green PCR Kits”). Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I im Master-Mix ermöglicht die Analyse vieler verschiedener Ziele, und zwar ganz ohne die Synthese von zielspezifischen markierten Sonden. Eine ausgewogene Kombination von K+- und NH4+-Ionen im PCR-Puffer sorgt für eine spezifische Primerhybridisierung und ermöglicht eine hohe Spezifität und Sensitivität der PCR (siehe Abbildung „Spezifische Primerhybridisierung“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders effizienten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.
Komponente | Eigenschaften | Vorteile |
HotStarTaq DNA Polymerase | Aktivierung binnen 15 Minuten bei 95 °C | Einrichtung der qPCR-Reaktionen bei Raumtemperatur |
QuantiTect SYBR Green PCR Buffer | Ausgewogene Kombination von NH4+- und K+-Ionen | Spezifische Primerhybridisierung sorgt für zuverlässige PCR-Ergebnisse |
dNTP-Gemisch | Enthält dUTP, das dTTP teilweise ersetzt und eine optionale UNG-Behandlung der Reaktionen ermöglicht | Verhindert die verschleppungsbedingte Kontamination der PCR-Produkte durch optionale UNG-Behandlung |
SYBR Green I-Farbstoff | Liefert ein starkes Fluoreszenzsignal bei der Bindung von doppelsträngiger DNA | Quantifizierung mit hoher Sensitivität |
ROX-Farbstoff | Zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen auf Geräten von Applied Biosystems und optional Agilent | Präzise Quantifizierung auf Thermocyclern, die ROX-Farbstoff benötigen. Keine Störung von Reaktionen auf anderen Real-time-Thermocyclern |
QuantiTect Probe PCR Kits enthalten einen optimierten, gebrauchsfertigen Master-Mix für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von gDNA- und cDNA-Zielen unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden (siehe Tabelle “Komponenten des 2x QuantiTect Probe PCR Kits”). Die Kits sind für die Verwendung mit allen Arten von sequenzspezifischen Sonden ausgelegt, einschließlich für den Nachweis von Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan®- und anderer doppelt markierter Sonden), FRET-Sonden und Molecular Beacons. Die QuantiTect Probe PCR Kits enthalten einen einzigartigen PCR-Puffer, der eine ausgewogene Kombination von K+- und NH4+-Ionen enthält, die für eine spezifische Primerhybridisierung sorgen und somit eine hohe Spezifität und Sensitivität der PCR ermöglichen (siehe Abbildung „Spezifische Primerhybridisierung“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders effizienten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.
Komponente | Eigenschaften | Vorteile |
HotStarTaq DNA Polymerase | Aktivierung binnen 15 Minuten bei 95 °C | Einrichtung der qPCR-Reaktionen bei Raumtemperatur |
QuantiTect Probe PCR Buffer | Ausgewogene Kombination von NH4+- und K+-Ionen | Spezifische Primerhybridisierung sorgt für zuverlässige PCR-Ergebnisse |
dNTP-Gemisch | Enthält dUTP, das dTTP teilweise ersetzt und eine optionale UNG-Behandlung der Reaktionen ermöglicht | Verhindert die verschleppungsbedingte Kontamination der PCR-Produkte durch optionale UNG-Behandlung |
ROX-Farbstoff | Zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen auf Geräten von Applied Biosystems und optional Agilent | Präzise Quantifizierung auf Thermocyclern, die ROX-Farbstoff benötigen. Keine Störung von Reaktionen auf anderen Real-time-Thermocyclern |
QuantiTect Multiplex PCR Kits ermöglichen eine erfolgreiche Zwei-Schritt-RT-PCR im Multiplex-Format beim ersten Versuch (siehe Flussdiagramm „ QIAGEN Multiplex-Kits“). Der optimierte Master-Mix sorgt dafür, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in einer entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktion. Mit dem Kit lassen sich bereits 10 Kopien eines Zielgens detektieren.
Die Amplifikation von Referenz- und Zielgenen in derselben Reaktion statt in getrennten Reaktionen erhöht die Zuverlässigkeit der Genquantifizierung, indem Handhabungsfehler auf ein Minimum reduziert werden. Der QuantiTect Multiplex PCR Master-Mix enthält eine ausgewogene Kombination von K+- und NH4+-Ionen sowie den einzigartigen synthetischen Faktor MP, die zusammen für eine stabile und effiziente Hybridisierung von Primern und Sonden an das Nukleinsäure-Template sorgen und so eine hohe PCR-Effizienz ermöglichen (siehe Tabelle „Komponenten des 2x QuantiTect Multiplex PCR Kits“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders effizienten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.
Die Master-Mixe in den QuantiTect-PCR-Kits enthalten zudem dUTP, was eine Vorbehandlung mit Uracil-N-Glykosylase (UNG) vor dem Start der PCR ermöglicht. Dadurch wird gewährleistet, dass etwaige kontaminierende PCR-Produkte die nachfolgenden PCR-Reaktionen nicht stören.
Komponente | Eigenschaften | Vorteile |
HotStarTaq DNA Polymerase | Aktivierung binnen 15 Minuten bei 95 °C | Einrichtung der qPCR-Reaktionen bei Raumtemperatur |
QuantiTect Multiplex PCR Buffer | Ausgewogene Kombination von NH4+- und K+-Ionen | Spezifische Primerhybridisierung sorgt für zuverlässige PCR-Ergebnisse |
Synthetischer Faktor MP | Zuverlässige Multiplex-Analyse von bis zu 4 Genen in demselben Röhrchen | |
dNTP-Gemisch | Enthält dUTP, das dTTP teilweise ersetzt und eine optionale UNG-Behandlung der Reaktionen ermöglicht | Verhindert die verschleppungsbedingte Kontamination der PCR-Produkte durch optionale UNG-Behandlung |
ROX-Farbstoff* | Zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen auf Geräten von Applied Biosystems und optional Agilent | Präzise Quantifizierung auf Thermocyclern, die ROX-Farbstoff benötigen. Keine Störung von Reaktionen auf anderen Real-time-Thermocyclern |
Die Reaktionen können bei Bedarf mit Uracil-N-Glykosylase (UNG) vorbehandelt werden, um Verschleppungen von PCR-Produkten aus früheren Reaktionen zu vermeiden. Für optimale Ergebnisse bei der Real-time-RT-PCR in zwei Schritten empfehlen wir die Synthese von cDNA mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit. Das Kit ermöglicht eine schnelle cDNA-Synthese in nur 20 Minuten bei gleichzeitiger Entfernung von Kontaminationen durch genomische DNA.
Bei den QuantiTect SYBR Green und Probe PCR Kits entfällt die Notwendigkeit, die Reaktionsbedingungen zu optimieren, was mitunter mühsam und zeitaufwändig sein kann. Geben Sie einfach Primer und DNA-Template zum gebrauchsfertigen PCR-Master-Mix und starten Sie die Reaktion. Befolgen Sie das Protokoll im Handbuch, um auf jedem Real-time-Thermocycler schnelle und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
Bei Verwendung der QuantiTect SYBR Green PCR Kits in Kombination mit QuantiTect Primer Assays sind hoch spezifische Ergebnisse bei der Genexpressionsanalyse garantiert. Dabei handelt es sich um bioinformatisch validierte Primer-Sets für die genomweite Detektion von Transkripten von Mensch, Maus, Ratte und vielen anderen Spezies. QuantiTect Primer Assays können bequem online bei GeneGlobe bestellt werden.
QuantiTect Multiplex PCR Kits enthalten gebrauchsfertige Master-Mixe, die eine Optimierung der Reaktions- und Zyklusbedingungen überflüssig machen. Das Handbuch enthält neben den empfohlenen Farbstoffen ein einziges Protokoll, das mit allen verfügbaren Real-time-Thermocyclern verwendet werden kann.
Die Kits sind mit oder ohne den passiven Referenzfarbstoff ROX im Master-Mix erhältlich, sodass sie auf praktisch jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden können (siehe Tabelle “Auswahl des richtigen QuantiTect Multiplex PCR Kits”). Dank der optimierten ROX-Konzentrationen wird der Nachweis selbst niedriger Kopienzahlen durch automatische Datenanalyse erreicht.
ROX-Farbstoff | Kit | Kompatible Thermocycler |
Enthalten im Master-Mix | QuantiTect Multiplex PCR Kit | Thermocycler von Applied Biosystems |
Nicht im Master-Mix enthalten | QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit | Rotor-Gene-Thermocycler und Thermocycler von Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche, Agilent und anderen Herstellern |
QuantiTect-PCR-Kits können für die Genexpressionsanalyse von cDNA oder die Quantifizierung von gDNA auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Dazu gehören Geräte von Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche und Agilent. Für Rotor-Gene Q und andere Rotor-Gene-Thermocycler empfehlen wir die Verwendung des Rotor-Gene SYBR Green PCR Kits, Rotor-Gene Probe PCR Kits oder Rotor-Gene Multiplex PCR Kits, die speziell für schnelle Zyklen auf diesen Geräten entwickelt wurden.
Eigenschaften | QuantiTect SYBR Green PCR Kits | QuantiTect Probe PCR Kits | QuantiTect Multiplex PCR Kits |
Anwendungen | Real-time-Quantifizierung von gDNA- oder cDNA-Zielen | Real-time-Quantifizierung von gDNA- oder cDNA-Zielen | Real-time-Quantifizierung von gDNA- oder cDNA-Zielen |
Reaktionstyp | PCR und Zwei-Schritt-RT-PCR | PCR und Zwei-Schritt-RT-PCR | Multiplex-PCR und Zwei-Schritt-RT-PCR im Multiplex-Format |
Real time oder Endpunkt | Real time | Real time | Real time |
Proben-/Zieltyp | DNA, cDNA | DNA, cDNA | DNA, cDNA |
Singleplex oder Multiplex | Singleplex | Singleplex | Multiplex |
SYBR Green I oder sequenzspezifische Sonden | SYBR Green I | Sequenzspezifische Sonden | Sequenzspezifische Sonden |
Thermocycler | Alle Real-time-Thermocycler (z. B. LightCycler, Rotor-Gene, ABI) | Die meisten Real-time-Thermocycler (z. B. LightCycler, Rotor-Gene, ABI) | Die meisten Real-time-Thermocycler (z. B. LightCycler, Rotor-Gene, ABI) |
Mit oder ohne ROX | Mit ROX | Mit ROX | Mit oder ohne ROX |