QuantiTect Virus Kits

Für den hoch sensitiven Nachweis von viraler RNA und/oder DNA

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QuantiTect Virus Kit (1000)

Cat. No. / ID: 211015

Für 1000 × 50-µl-Reaktionen: QuantiTect Virus Master Mix (enthält ROX-Farbstoff), QuantiTect Virus RT Mix, RNase-freies Wasser, QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer

Reference dye

Rox in Mastermix

Rox in vial

Reactions

1000

200

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QuantiTect Virus Kits sind für molekularbiologische Anwendungen vorgesehen. Diese Produkte sind nicht zur Diagnose, Prävention oder Behandlung einer Erkrankung vorgesehen.

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Eigenschaften

Hohe Sensitivität in Single- und Multiplex-Assays
Nachweis von viraler RNA und/oder DNA in der gleichen Reaktion
Eindeutiger Nachweis von schwach-positiven Signalen
Schnelle, universelle 2-Schritt-Protokolle
5x Master-Mix für höhere Sensitivität bei größeren Probenmengen

Angaben zum Produkt

Das QuantiTect Virus Kit wurde speziell für den hoch sensitiven Nachweis von bis zu 4 viralen Nukleinsäurezielen mittels Ein-Schritt-Real-time-RT-PCR im Multiplex-Format unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden entwickelt. Mehrere virale RNA- und/oder DNA-Ziele sowie interne Kontrollen können in einem einzelnen Röhrchen ohne Sensitivitätsverlust nachgewiesen werden. Der konzentrierte 5x Master-Mix ermöglicht die Zugabe einer höheren Probenmenge und enthält HotStarTaq Plus DNA Polymerase. Der QuantiTect Virus RT Mix enthält eine einzigartige Formulierung von Sensiscript Reverse Transcriptase, die für den hoch sensitiven Nachweis viraler RNA optimiert ist. Es sind zwei Kit-Formate erhältlich: das QuantiTect Virus Kit für Thermocycler, die ROX-Farbstoff zur Fluoreszenznormalisierung benötigen, und das QuantiTect Virus +ROX Vial Kit für andere Thermocycler. Der Master-Mix kann bei 2–8 °C gelagert werden.

Leistung

Die Amplifikation mit QuantiTect Virus Kits liefert steile sigmoidale Kurven über einen weiten Verdünnungsbereich, selbst bei geringen Template-Mengen mit hohen C_T-Werten (siehe Abbildung „ Eindeutige Bestimmung der C_T-Werte über einen breiten dynamischen Bereich“). Dies ermöglicht die genaue Bestimmung des C_T-Werts bei der Quantifizierung viraler Nukleinsäuren mittels Real-time-PCR.

Multiplex-Assays ermöglichen den Nachweis mehrerer viraler RNA- und/oder DNA-Ziele sowie interner Kontrollen über einen breiten linearen Bereich ohne Verlust an Sensitivität (siehe Abbildungen „ Zuverlässiger Nachweis viraler RNA über einen breiten linearen Bereich“ und „ Verbesserter Nachweis geringer Mengen viraler RNA“).

Der in den Kits enthaltene QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer stabilisiert die RNA- und DNA-Standards während der Verdünnung und des Reaktionsansatzes und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren durch Adsorption an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen. Der Puffer ermöglicht eine zuverlässige Verdünnung von Standards, die zur Quantifizierung viraler Nukleinsäuren verwendet werden, und bietet so einen breiten linearen Bereich, der von niedrigen bis zu hohen C_T-Werten reicht. Außerdem ermöglicht er eine längere Lagerung der Standards ohne Abbau (siehe Abbildung „ Zuverlässige Verdünnung und Lagerung von RNA-Standards“).

Abbildungen ansehen

Eindeutige Bestimmung der C_T-Werte über einen breiten dynamischen Bereich

Zuverlässiger Nachweis viraler RNA über einen breiten linearen Bereich

Verbesserter Nachweis geringer Mengen viraler RNA

Zuverlässige Verdünnung und Lagerung von RNA-Standards

Prinzip

Die QuantiTect Virus Kits ermöglichen auf Anhieb einen hoch sensitiven Nachweis viraler Nukleinsäuren in Singleplex- oder Multiplex-Assays (siehe Flussdiagramm „ QIAGEN Multiplex-Kits“). Der optimierte Master-Mix sorgt dafür, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in einer entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktion.

Die Amplifikation von Kontroll- und Zielgenen in derselben Reaktion statt in getrennten Reaktionen erhöht die Zuverlässigkeit der Genquantifizierung, da Handhabungsfehler minimiert werden. Der QuantiTect Virus Buffer enthält eine ausgewogene Kombination aus K⁺- und NH₄⁺-Ionen sowie den einzigartigen synthetischen Faktor MP. Zusammen sorgen sie für eine stabile und effiziente Hybridisierung der Primer und Sonden an das Nukleinsäure-Template und gewährleisten so eine hohe PCR-Effizienz (siehe Abbildung „ Einzigartiger PCR-Puffer“). Darüber hinaus sorgt die einzigartige Formulierung der Sensiscript Reverse Transcriptase für eine hoch sensitive reverse Transkription viraler RNA, während die HotStarTaq Plus DNA Polymerase einen stringenten Hot-Start gewährleistet und die Bildung unspezifischer Produkte verhindert.

Komponenten des QuantiTect Virus Kits
	Kit-Komponente	Eigenschaft	Vorteile
5x QuantiTect Virus Master Mix	Konzentrierter Master-Mix	Hochkonzentriert und optimiert für den sensitiven Virusnachweis	Zur Erhöhung der Sensitivität können dem Assay größere Volumen an Template zugegeben werden
	HotStarTaq Plus DNA Polymerase	Aktivierung innerhalb von 5 Minuten bei 95 °C	Ansatz der qPCR-Reaktionen bei Raumtemperatur
	QuantiTect Virus Buffer	Ausgewogene Kombination von NH₄⁺- und K⁺-Ionen	Spezifische Primerhybridisierung für zuverlässige PCR-Ergebnisse
	QuantiTect Virus Buffer	Synthetischer Faktor MP	Zuverlässige Multiplex-Analyse von bis zu 4 Genen in einem Röhrchen
Zusätzliche Kit-Komponenten	QuantiTect Virus RT Mix	Enthält eine einzigartige Formulierung der Sensiscript Reverse Transcriptase	Optimiert für den hoch sensitiven Nachweis von viraler RNA
Zusätzliche Kit-Komponenten	QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer	Proprietäre Pufferformulierung für die Verdünnung und Lagerung von Nukleinsäurestandards.	Stabilisiert RNA- und DNA-Standards während der Verdünnung und des Reaktionsansatzes und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren durch Adsorption an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen

Abbildungen ansehen

QIAGEN Multiplex-Kits

Einzigartiger PCR-Puffer

Verfahren

QuantiTect Virus Kits ermöglichen eine hoch sensitive Real-time-PCR-Analyse von viralen Nukleinsäuren (RNA und/oder DNA) und internen Kontrollen unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden. Die Reaktionen können mit oder ohne reverse Transkription durchgeführt werden. Dies ermöglicht ein flexibles Design von Multiplex-Assays zum Nachweis von RNA-Zielen, DNA-Zielen oder sowohl RNA- als auch DNA-Zielen. Befolgen Sie das Protokoll im Handbuch für schnelle und zuverlässige Ergebnisse.

Die Kits sind mit oder ohne passiven Referenzfarbstoff ROX im Master-Mix erhältlich (siehe Tabelle).

Auswahl des richtigen QuantiTect Virus Kits
ROX-Farbstoff	Kit	Kompatible Thermocycler
Im Master-Mix enthalten	QuantiTect Virus Kit	Alle Thermocycler von Applied Biosystems außer Applied Biosystems 7500
Wird in einem separaten Röhrchen geliefert	QuantiTect Virus +ROX Vial Kit	Applied Biosystems 7500 und Thermocycler von Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, QIAGEN, Roche, Agilent und anderen Herstellern

Für schnelle und hoch sensitive Endpunkt-Ein-Schritt-RT-PCR-Anwendungen, einschließlich des Nachweises von Viren, empfehlen wir das QIAGEN OneStep RT-PCR Kit.

Anwendungen

Die QuantiTect Virus Kits ermöglichen eine hoch sensitive Real-time-PCR im Single- oder Multiplex-Format oder eine Ein-Schritt-RT-PCR mit sequenzspezifischen Sonden für den Nachweis von viraler DNA und/oder RNA sowie interner Kontrollen. Die Kits können auf einer Vielzahl von Real-time-Thermocyclern eingesetzt werden, darunter Geräte von Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, QIAGEN, Roche (außer Kapillar-Thermocycler) und Agilent.

Ergänzende Daten und Abbildungen

Eindeutige Bestimmung der C_T-Werte über einen breiten dynamischen Bereich

Serielle Verdünnungen der RNA des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus (BVDV) wurden wie angegeben amplifiziert und mit dem QuantiTect Virus Kit analysiert. Die steilen sigmoidalen Kurven ermöglichen eine genaue Bestimmung des C_T-Werts, selbst bei geringen Template-Mengen (10 Kopien/μl). [A] Nachweis von BVDV1-RNA. [B] Nachweis von BVDV2-RNA. NTC: No template control (Kontrolle ohne Template).

Specifications

Features	Specifications
Applications	Virusnachweis
SYBR Green I or sequence-specific probes	Sequenzspezifische Sonden
Real-time or endpoint	Real-time
Reaction type	Reverse Transkription und PCR
Thermal cycler	Die meisten Real-time-Thermocycler (außer Kapillar-Thermocycler, z. B. LightCycler® 1.x und 2.0)
Sample/target type	RNA- und/oder DNA-Ziele
With or without ROX	Erhältlich mit ROX im Master-Mix und ROX in einem separaten Röhrchen
Single or multiplex	Single- oder Multiplex

Ressourcen

Now with even more applications!

For highly sensitive real-time singleplex or multiplex PCR or one-step RT-PCR using sequence-specific probes for detection of viral DNA and RNA and internal controls

FAQ

Ensure PCR amplicons are as short as possible, ideally 60–150 bp. Always use the same algorithm or software to design the primers and probes. For optimal results, only combine assays that have been designed using the same parameters.

Check the functionality of each set of primers and probes in individual assays before combining the different sets in the multiplex assay. Choose compatible reporters and quenchers based on a specific instrument. See How do I select appropriate reporter and quencher combinations for multiplex PCR.

FAQ ID -9093

No. UNG treatment does not provide any advantage for the QuantiFast and Rotor-Gene PCR kits because the mastermixes do not contain dUTP. Use the QuantiTect kits if you intend to use the UNG treatment.

FAQ ID -9092

If the extra peaks seem irregular or noisy, do not occur in all samples, and occur at temperatures less than 70 ºC, then these peaks may not represent real PCR products and instead may represent artifacts caused by instrument settings.

Usually extra peaks caused by secondary products are smooth and regular, occur reproducibly in most samples, and occur at temperatures greater than 70 ºC. Characterization of the product by agarose gel electrophoresis is the best way to distinguish between these cases. If only one band appears by agarose gel then the extra peaks in the dissociation curve are instrument artifacts and not real products. If this is the case, refer to the thermal cycler user manual, and confirm that all instrument settings (smooth factor, etc.) are set to their optimal values.

FAQ ID -90990

The REST 2009 (Relative Expression Software Tool) software applies mathematic models that compensate for the different PCR efficiencies of the gene of interest and reference genes. In addition, the software can use multiple reference gene normalization to improve the reliability of result, as well as provides statistical information suitable for robust comparison of expression in groups of treated and untreated. QIAGEN offers the REST 2009 software free of charge.

FAQ ID -9095

The Ct or threshold cycle value is the cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold, a fluorescent signal significantly above the background fluorescence. At the threshold cycle, a detectable amount of amplicon product has been generated during the early exponential phase of the reaction. The threshold cycle is inversely proportional to the original relative expression level of the gene of interest.

FAQ ID -2682

Check the template quality and integrity by amplifying an endogenous control gene. Check the amplicon by QIAxcel Advanced system or agarose gel electrophoresis to show that amplification was successful.

Determine whether the gene of interest is expressed in your sample. See How can I find out if my gene of interest is express in a specific tissue type or cell line. Ensure the assay setup and cycling conditions are correct, and that the data collection channel matches the emission wavelength of the fluorescent dye used. Use a control sample in which the gene of interest is definitely expressed.

If the issue persists, please send the original run file to QIAGEN Technical Services.

FAQ ID -9091

For duplex analysis, using non-fluorescent quenchers (e.g., Black Hole Quencher^®) is preferred over fluorescent quenchers (e.g., TAMRA fluorescent dye). For triplex and 4-plex analysis, QIAGEN strongly recommends using non-fluorescent quenchers. Generally, use the green channel, the yellow channel, and the orange and crimson channels to detect the least abundant target, the second least abundant target, and the two most abundant targets, respectively. For instrument-specific recommendations, please see the handbooks for the QuantiTect Multiplex PCR kit, QuantiFast Multiplex kit or Rotor-Gene Multiplex kit.

FAQ ID -9094

The gDNA wipeout buffer incubation step can be skipped when the total RNA is free from genomic DNA. However, the gDNA wipeout buffer is still required to be added because the reverse transcription step is optimized in the presence of components in the gDNA wipeout buffer.

FAQ ID -9098

Store the standards at a high concentration in aliquots at -20^oC to -70^oC. If using low concentrations, stabilize standards with carrier nucleic acid. It is always best to use freshly diluted standards for each experiment. If possible, use siliconized tubes for standard (and target) dilutions. This will prevent any unspecific binding of nucleic acids to the plastic.

FAQ ID -9099

Reliable HRM analysis results depend on template quality, highly specific HRM PCR kit with a saturation dye, a real-time instrument with HRM capability, and powerful software package. Factors critical for successful HRM analysis are:

Use the same genomic DNA purification procedure for all samples being analyzed by HRM. This avoids variation due to differing composition of elution buffers.
DNA template concentrations should be normalized using the same dilution buffer. Ensure the C_T values are below 30 and differ no more than 3 C_T values across individual samples.
Design assays with amplicon length 70–350 bp. For SNP analysis, use amplicon length 70–150 bp.
Always start with 0.7 µM primer concentration

For more details, please refer to the HRM Technology – FAQs and the Critical Success Factor for HRM performance.

FAQ ID -9097

Shorter amplification products facilitate high PCR efficiencies. Ideally, amplicon length should be less than 150 bp for optimal amplification efficiency. PCR efficiencies close to 100% are a crucial prerequisite for accurate quantification of target copy numbers in real-time PCR.

FAQ ID-751

The QuantiTect Virus Kit and the new QuantiFast Pathogen +IC Kits are based on similar reaction chemistry and show identical sensitivity but as a new feature, the QuantiFast Pathogen kits include an Internal Control template and the corresponding primer/probe set for duplex amplification of a user-defined pathogen target with the provided Internal Control. Additional new features are pack size, kit variants, ROX variants, and speed.

FAQ ID -2448

Yes, the Internal Control RNA (High conc.) and Internal Control DNA (High conc.) templates are available under a separate catalog number. After reconstitution according to the description in the handbook, these IC templates have a 10x higher concentration than the Internal Control templates provided in the kits. They are sufficiently concentrated to be spiked into the sample prep without replacing too much of the sample input volume.

**Please note that there is no assay (primer/probe set) for amplification of the IC included in these separate catalog numbers. The assay is only included in the QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit and QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit. The ICs cannot be used with the QuantiTect Virus kits because the assay (primer/probe set) for the detection of the IC is provided with the QuantiFast Pathogen Kits only.

FAQ ID -2451

Depending on primer design and copy number of target, primer-dimer may occur and its signal might be detected. Typical strategies against this are to optimize PCR conditions and/or redesign the assay.

Alternatively, an additional data-acquisition step can be added to the 3-step cycling protocol. First, determine the melting temperatures (T_m) for both the amplicon and the primer-dimer. Then, add a 15 second data-acquisition step with a temperature that is higher than the primer-dimer T_m, but approximately 3ºC lower than the specific amplicon T_m.

FAQ ID -9096

QuantiTect Virus Kits

Für den hoch sensitiven Nachweis von viraler RNA und/oder DNA

QuantiTect Virus Kit (1000)

Eigenschaften

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Leistung

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Verfahren

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Ergänzende Daten und Abbildungen

Eindeutige Bestimmung der CT-Werte über einen breiten dynamischen Bereich

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Eindeutige Bestimmung der C_T-Werte über einen breiten dynamischen Bereich