dPCR Probe Assays für Kopienzahlvariation (CNV)

• Mehr als 200 im Wet-Lab validierte Assays und ein Tool für die kundenspezifische In-silico-Assayentwicklung
• Farbstoffauswahl ermöglicht das Multiplexing mit bis zu 5 Zielen je Reaktion
• Zielgen-, Referenz- und Zentromerreferenzassays verfügbar
• Gebrauchsfertige Assays wurden für viele verschiedene Proben wie FFPE, Zelllinien und gDNA validiert
• Einfacher und schneller dPCR-Workflow auf dem QIAcuity
• Komfortable Auswertung der Kopienzahldaten mit der QIAcuity Software Suite

dPCR CNV Probe Assays ermöglichen die spezifische, genaue, reproduzierbare und leicht zu interpretierende Auswertung von Kopienzahlveränderungen für einzelne Gene oder Regionen von Interesse. Assays für mehr als 200 Ziele wurden im Wet-Lab mittels PCR validiert und sind in der jeweiligen Assaybeschreibung entsprechend gekennzeichnet.

Darüber hinaus steht ein Tool für die kundenspezifische Assayentwicklung zur Verfügung, um Anforderungen außerhalb des im Wet-Lab validierten Assayangebots zu erfüllen.

Die dPCR CNV Probe Assays sind im Röhrchenformat als gebrauchsfertiger, 20-fach konzentrierter Assay erhältlich. Das Röhrchen enthält das Primerpaar und eine Hydrolysesonde zur Verwendung mit dem QIAcuity Probe PCR Kit (DNA-Ziele), dem QIAcuity Digital PCR System und QIAcuity Nanoplates .

Jeder Assay ermöglicht die Auswahl zwischen fünf verschiedenen Hydrolysesonden (Fluorophoren): FAM, HEX, ROX, Atto 550 und Cy5. Diese Flexibilität ermöglicht die beliebige Kombination von Assays für Multiplex-Analysen von bis zu fünf Zielen in einer einzigen dPCR-Reaktion.

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Außergewöhnliche Assayleistung

Die dPCR CNV Probe Assays überzeugen durch eine exzellente Produktamplifikation und Trennung zwischen den negativen und positiven Partitionsclustern in einer Duplex-Analyse unter Einsatz von zwei verschiedenen Konzentrationen des gDNA-Templates (siehe 1D- und 2D-Streudiagramme der Duplex-Reaktionen für KRAS- und TERT-Assays). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine genaue Analyse von CNVs selbst bei niedrigen Konzentrationen der eingesetzten gDNA durchgeführt werden kann. Die minimalen und maximalen Beladungsmengen für 8.5k-Nanoplatten entnehmen Sie bitte der Erweiterung des QIAcuity Benutzerhandbuchs.

Präzise und reproduzierbare Kopienzahlanalyse mittels digitaler PCR

Das hochreproduzierbare QIAcuity dPCR System und die dPCR CNV Probe Assays ermöglichen eine CNV-Analyse ohne Replikate, was den Probendurchsatz auf kosteneffektive Weise steigert. Die Duplex-Analyse einer gDNA-Probe führte zu der erwarteten Anzahl an Kopien je Genom für alle Replikate (siehe Genaue und reproduzierbare Kopienzahlanalyse in einer Duplex-Reaktion). In einem Präzisionstest zur Analyse einer gDNA-Verdünnungsreihe zeigen die Assays eine ausgezeichnete lineare Verteilung und Clustertrennung (siehe Lineare Verteilung in einem Verdünnungsreihen-Präzisionstest).

Multiplex-Kopienzahlanalyse mittels dPCR

Multiplex-Analysen mit den dPCR CNV Probe Assays steigern den Durchsatz und reduzieren die Analysekosten je Ziel signifikant. Die Möglichkeit, diese Assays mit verschiedenen Farbstoffen (FAM, HEX, ROX, Atto 550 und Cy5) zu bestellen, erlaubt ein flexibles Experimentdesign und die Multiplex-Analyse von bis zu 5 Zielen gleichzeitig in einer einzigen Reaktion. Die dPCR CNV Probe Assays zeigen eine ausgezeichnete Amplifikation und Trennung zwischen positiven und negativen Clustern für 5 in einer einzigen Reaktion multiplexierte Assays (siehe CNV-Nachweis in einer 5-plex-Reaktion).

Alle dPCR CNV Probe Assays sind für bestimmte Regionen des menschlichen Genoms konzipiert. Die dPCR CNV Probe Gene of Interest Assays zielen auf gut erforschte Krebsgene und krebsassoziierte Gene ab. Die dPCR CNV Probe Reference Assays und dPCR CNV Probe Centromeric Reference Assays umfassen eine Vielzahl von Referenzen mit unterschiedlichen Kopienzahlen je Genom, sodass für jede Analyse die optimalen Normalisierungsreferenzen ausgewählt werden können. Abhängig von den experimentellen Bedingungen können in die Reaktionen mehrere GOI- und Referenzassays aufgenommen werden, um eine genaue Berechnung der Kopienzahl des Gens oder Ziels von Interesse zu ermöglichen.

Die dPCR Copy Number Probe Assays sind gebrauchsfertig: Einfach die einzelnen Assay-Gemische zur DNA-Probe und dem Master-Mix aus dem QIAcuity Probe PCR Kit geben, in die QIAcuity Nanoplate laden und den Lauf auf dem QIAcuity Gerät starten. Jeder Assay basiert auf der Endpunkt-PCR-Amplifikation einer spezifischen Region von Genen im menschlichen Genom. Das amplifizierte Produkt wird mithilfe zielspezifischer fluoreszierender Hydrolysesonden nachgewiesen, die helfen, eine hohe Assay-Spezifität zu gewährleisten.

Das Prinzip der dPCR-Reaktion in den Nanoplatten finden Sie hier beschrieben.

Die Versuchseinrichtung ist einfach und unkompliziert und kann in jedem Labor durchgeführt werden, das mit dem QIAcuity dPCR Gerät arbeitet. Für eine präzisere Kopienzahlanalyse empfehlen wir, nach der Isolation der genomischen DNA aus der Probe einen Verdau mit Restriktionsenzym durchzuführen. Bei hochfragmentierter DNA (z. B. FFPE-DNA oder zirkulierender DNA) oder cDNA ist ein Restriktionsverdau nicht erforderlich. Um den Restriktionsverdau direkt im Reaktionsgemisch durchzuführen, geben Sie das empfohlene Restriktionsenzym während der Reaktionseinrichtung hinzu. Es ist von zentraler Bedeutung, die Verwendung von Restriktionsenzymen zu vermeiden, die innerhalb des Zielamplifikatbereichs schneiden.

Das fragmentierte Template wird dann mit dem gebrauchsfertigen QIAcuity Probe PCR Kit Master-Mix und dem dPCR CNV Probe Assay gemischt und dieses Gemisch wird in die einzelnen Wells der dPCR-Vorplatte aliquotiert. Das Reaktionsgemisch wird dann durch Pipettieren gut durchmischt und in die Wells einer QIAcuity Nanoplate überführt. Jedes Gen oder Ziel von Interesse und jeder Referenzassay können in einer Multiplex-Reaktion durch Kombination mit verschiedenen Fluorophoren in einem einzigen Well analysiert werden.

Nach dem Laden und Versiegeln der Nanoplatte wird das empfohlene Cycling-Programm auf dem QIAcuity Gerät ausgeführt. Die sich dabei ergebenden Kopien pro Mikroliter werden im Analysetyp Absolute Quantifizierung der QIAcuity Software Suite angezeigt. Zur Berechnung der Kopienzahl je Genom wählen Sie in der QIAcuity Software Suite den Datentyp Kopienzahlanalyse aus und definieren die Nanoplatten-Kavitäten für das Gen/die Region von Interesse bzw. die Standardisierungsreferenz. Abhängig vom Cycling-Protokoll können die Ergebnisse des dPCR-Laufs nach ~2 Stunden in der QIAcuity Software Suite analysiert werden.

dPCR CNV Probe Assays eignen sich hervorragend für den genauen Nachweis von Kopienzahlveränderungen oder -variationen an einzelnen Loci unter Verwendung von DNA aus frischen, gefrorenen oder fixierten Proben.