QuantiNova-RT-PCR-Kits

• Einzigartiges zweiphasiges Hot-Start-Verfahren für den Reaktionsansatz bei Raumtemperatur
• Visuelle Pipettierkontrolle zur Minimierung von Pipettierfehlern
• Interne Kontrolle für die positive In-Prozess-Überprüfung der erfolgreichen RT-PCR
• Genaue Quantifizierung über mehrere logarithmische Größenordnungen an Template-Mengen
• Sensitiver Nachweis von bis zu 5 Zielen in 1 Röhrchen

QuantiNova-RT-PCR-Kits (Real-time-RT-PCR-Kits) ermöglichen die sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mittels Real-time-Ein-Schritt-PCR unter Verwendung von SYBR Green I oder sequenzspezifischen Sonden. Eine Kombination aus verschiedenen integrierten Sicherheitsfunktionen beseitigt Variablen und verhindert Artefakte, wodurch eine zuverlässige Erstellung von Genexpressionsprofilen gewährleistet wird. Die Kombination aus dem einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Mechanismus und dem PCR-Puffersystem im gebrauchsfertigen Master-Mix ermöglicht den Reaktionsansatz bei Raumtemperatur und gewährleistet eine hoch sensitive qRT-PCR auf jedem Real-time-Thermocycler. Die optionale QuantiNova Internal Control RNA kann verwendet werden, um die erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler beim Ansetzen von Assays und das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen. Zur Bestätigung der korrekten Pipettierung kann darüber hinaus die visuelle Pipettierkontrolle verwendet werden. Die integrierte gDNA-Reduktion im QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren verhindert eine überhöhte Quantifizierung von Transkripten durch die Verschleppung von genomischer DNA.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit ermöglicht die schnelle und zuverlässige Quantifizierung von bis zu 5 RNA-Zielen in einem einzelnen Röhrchen mittels Real-time-PCR im Multiplex-Format. Unsere Q-Bond-Technologie und ein optimierter Master-Mix ermöglichen eine ultraschnelle Real-time-RT-PCR im Multiplex-Format innerhalb von 1 Stunde. Die Kombination eines einzigartigen zweiphasigen Hot-Start-Verfahrens mit unserem Multiplex-PCR-Puffersystem gewährleistet eine hoch sensitive qRT-PCR auf einem beliebigen Real-time-Thermocycler ohne Optimierung und mit der Möglichkeit zum automatisierten Reaktionsansatz bei Raumtemperatur. Das Kit enthält auch Protokolle für extrahierte RNA und die direkte Amplifikation aus Zellkulturen, und zwar ab einer einzelnen Zelle. Die optionale QuantiNova Internal Control RNA kann verwendet werden, um die erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen, und die visuelle Pipettierkontrolle dient zur Überwachung der korrekten Pipettierung.

Integrierter visueller Indikator für genauen Reaktionsansatz

Der mit den QuantiNova-RT-PCR-Kits mitgelieferte Master-Mix enthält einen inerten blauen Farbstoff, der die Real-time-PCR nicht stört, aber die Sichtbarkeit im Röhrchen oder Well erhöht. Der QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer enthält einen inerten gelben Farbstoff. Wenn die Template-Nukleinsäure mit QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer verdünnt und dem Master-Mix zugegeben wird, wechselt die Farbe der Lösung von Blau nach Grün (siehe Abbildung “ Genauer Reaktionsansatz, nachgewiesen durch die integrierte Pipettierkontrolle”). Dadurch erhalten Sie eine visuelle Bestätigung, dass jede Reaktion korrekt angesetzt wurde.

QuantiNova SYBR Green und QuantiNova Probe RT-PCR Kits

QuantiNova SYBR Green und QuantiNova Probe RT-PCR Kits nutzen ein zweiphasiges Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung “ Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus”). Dazu gehört die thermische Aktivierung der HotStaRT-Script reversen Transkriptase bei 50 °C (SYBR Green- und Multiplex-Kits) oder 45 °C (Sonden-Kit) und der PCR-Polymerase bei 95 °C. Bei niedrigen Temperaturen bildet die HotStaRT-Script einen Komplex mit einem RT-Blocker-Molekül, und wird so inaktiviert. Bei 50 °C (SYBR Green- und Multiplex-Kits) oder 45 °C (Sonden-Kit) dissoziiert der Komplex und das aktive HotStaRT-Script-Enzym wird freigesetzt. Die QuantiNova DNA Polymerase wird durch den QuantiNova Antibody und das QuantiNova Guard, ein neuartiges komplexstabilisierendes Additiv, in einem inaktiven Zustand gehalten. Dies verbessert die Stringenz des Hot-Start-Verfahrens und verhindert die Extension von unspezifisch hybridisierten Primern und Primer-Dimeren. Innerhalb von 2 Minuten (SYBR Green- und Multiplex-Kits) bzw. 5 Minuten (Sonden-Kit) nach Temperaturerhöhung auf 95 °C werden der QuantiNova Antibody und das QuantiNova Guard denaturiert und die QuantiNova DNA Polymerase wird aktiviert, was die PCR-Amplifikation ermöglicht. Dieses einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren sorgt dafür, dass der Reaktionsansatz bei Raumtemperatur mindestens 2 Stunde lang stabil bleibt (siehe Abbildung “ Bequemer Reaktionsansatz bei Raumtemperatur ohne Leistungseinbußen”), was die Entstehung von Artefakten verhindert und außerdem den automatisierten Reaktionsansatz erleichtert.

Die QuantiNova DNA Polymerase und die einzigartige Zusammensetzung des RT-PCR-Puffers ermöglichen eine sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich, die auf jedem handelsüblichen Thermocycler durchgeführt werden können (siehe Abbildung “ Genaue Quantifizierung bei sehr hohen oder sehr niedrigen Ausgangsmengen”).

Der gDNA-Reduktionsschritt in QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren minimiert die durch Verschleppung genomischer DNA verursachte Fehlquantifizierung. Die Reduktion der genomischen DNA ist von entscheidender Bedeutung für genaue Genexpressionsergebnisse und macht die Entwicklung RNA-spezifischer Primer oder Sonden überflüssig. Mit der integrierten gDNA-Reduktion (siehe Abbildung “ Erhöhte Zuverlässigkeit der Genexpressionsergebnisse durch gDNA-Reduktion”) werden Zeit und Kosten gespart, da ein separater DNase-Verdau während oder nach der Aufreinigung der RNA-Proben nicht erforderlich ist.

Die neu entwickelte interne Kontrolle ist ein definiertes Transkript (RNA-Molekül), das einfach zu Ihren Proben zugegeben und zu cDNA transkribiert werden kann. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler beim Ansetzen von Assays oder das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen. Da sich die interne Kontrolle ähnlich verhält wie echte Transkripte (siehe Abbildung “ Zuverlässige Überwachung der RT-PCR-Inhibition”), kann sie zur Bestätigung der erfolgreichen reversen Transkription und Amplifikation verwendet werden. Die Duplex-Kapazität ermöglicht außerdem die Einbindung der internen Kontrolle oder eines Referenzgens zum direkten Vergleich mit dem Zielgen.

Die QuantiNova DNA Polymerase und die einzigartige Zusammensetzung des RT-PCR-Puffers ermöglichen eine sensitive Quantifizierung von RNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich auf jedem handelsüblichen Thermocycler.

QuantiNova Multiplex RT-PCR Kits

Der im QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit enthaltene spezielle Master-Mix ermöglicht den einfachen Ansatz von Multiplex-Reaktionen und gewährleistet, dass die Ergebnisse mit denen einer Singleplex-RT-PCR vergleichbar sind. Der hochkonzentrierte 4x Master-Mix ermöglicht den Einsatz von bis zu 800 ng Template und bietet eine herausragende Sensitivität bis hin zu 5-Plex-Reaktionen.

Das Kit kann kleine Unterschiede in der Menge des Templates eindeutig unterscheiden und ermöglicht eine genaue Quantifizierung von Zielen mit sehr unterschiedlicher Abundanz (siehe Abbildung “ Hoch sensitiver Multiplex-Nachweis von Zielen mit unterschiedlicher Abundanz”). Darüber hinaus steht ein einfaches Protokoll für die direkte Amplifikation aus Zellkulturen zur Verfügung, das die RNA-Analyse sogar schon aus einer einzelnen Zelle ermöglicht (siehe Abbildung “ Multiplex-Genexpressionsanalyse an einzelnen Zellen”). Das einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren (siehe Abbildung “ Prinzip des neuartigen zweiphasigen QuantiNova-Hot-Start-Mechanismus”) gewährleistet eine herausragende Spezifität und ermöglicht den Reaktionsansatz bei Raumtemperatur, was sich besonders gut für automatisierte Verfahren eignet. Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält das Additiv Q-Bond, das die Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt, sodass eine Multiplex-qRT-PCR in etwa einer Stunde möglich ist. Die Integration einer visuellen Pipettierkontrolle erhöht die interne Prozesssicherheit, indem menschliche Fehler minimiert werden (siehe Abbildung “ Genauer Reaktionsansatz, nachgewiesen durch die integrierte Pipettierkontrolle”). Die optionale Internal Control RNA, die zusammen mit den Zielen detektiert werden kann, beseitigt Variationen, die durch Inhibitoren oder andere Faktoren verursacht werden, und ermöglicht die Überwachung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit. Insgesamt erhöht unser ultraschneller und durch In-Prozess-Kontrollen abgesicherter Multiplex-qRT-PCR-Workflow die Effizienz, indem mehr Erkenntnisse aus begrenztem Probenmaterial gewonnen werden können.

QuantiNova-RT-PCR-Kits enthalten optimierte, gebrauchsfertige Master-Mixe für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von RNA-Zielen mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I oder sequenzspezifischen Sonden. Das QuantiNova Probe RT-PCR Kit wurde für die Verwendung mit verschiedenen Arten sequenzspezifischer Sonden entwickelt, einschließlich Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan- und anderer doppelt markierter Sonden) und Scorpions-Primern. Die Kits enthalten einen einzigartigen PCR-Puffer, der eine ausgewogene Kombination von K⁺- und NH₄⁺-Ionen enthält, die für eine spezifische Primerhybridisierung sorgen und somit eine hohe Spezifität und Sensitivität gewährleisten. Außerdem ermöglicht die HotStaRT-Script die cDNA-Synthese über einen großen Bereich von RNA-Template-Mengen. Die QuantiNova DNA Polymerase sorgt dagegen für ein stringentes Hot-Start-Verfahren, das die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert. Durch das einzigartige zweiphasige Hot-Start-Verfahren bleiben Reaktionsansätze bei Raumtemperatur bis zu 2 Stunden lang stabil, was einen automatisierten Reaktionsansatz ermöglicht.

Mit Hilfe der integrierten visuellen Kontrolle können Sie überprüfen, ob das Template der Reaktion zugegeben wurde und somit Pipettierfehler beim Reaktionsansatz vermeiden.

Der Nachweis von Variationen bei der cDNA-Synthese ermöglicht es, die Reproduzierbarkeit Ihrer Ergebnisse zu überprüfen. Die neu entwickelte interne Kontrolle ist ein definiertes Transkript (RNA-Molekül), das bei Bedarf zu Ihren Proben zugegeben und zu cDNA transkribiert werden kann. Sie dient dazu, Geräte- oder Chemieversagen, Fehler beim Ansetzen von Assays und das Vorliegen von Inhibitoren anzuzeigen.

Um bei Real-time-RT-PCR-Genexpressionsassays genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, dass nur cDNA amplifiziert und detektiert wird. Störungen durch genomische DNA werden bei QuantiNova-Sonden-RT-PCR-Verfahren durch den gDNA-Reduktionsschritt verhindert (siehe Abbildung “ Erhöhte Zuverlässigkeit der Genexpressionsergebnisse durch gDNA-Reduktion”). Zeit und Kosten werden gespart, da ein separater DNase-Verdau während oder nach der Aufreinigung der RNA-Proben nicht erforderlich. Außerdem müssen keine RNA-spezifischen Primer oder Sonden entwickelt werden.
Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit liefert ohne Optimierung hoch sensitive und schnelle Ergebnisse über einen breiten dynamischen Bereich auf Standard- und Fast-Thermocyclern. Der speziell entwickelte PCR-Puffer enthält das Additiv Q-Bond, das die Hybridisierungs- und Extensionszeiten erheblich verkürzt. Die Amplifikation von Referenz- und Zielgenen in derselben Reaktion erhöht die Zuverlässigkeit, indem Variationen zwischen Wells und Handhabungsfehler minimiert werden. Zusätzlich ist eine Internal Control RNA für den gleichzeitigen Nachweis enthalten, um eine erfolgreiche reverse Transkription und qPCR zu bestätigen.

QuantiNova SYBR Green und Probe RT-PCR Kits machen die mühsame und zeitaufwändige Optimierung der Reaktionsbedingungen überflüssig. Geben Sie einfach Primer, RNA-Template und RT-Mix zur gebrauchsfertigen RT-PCR oder zum Master-Mix hinzu und starten Sie die Reaktion. Befolgen Sie das Protokoll im Handbuch des QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kits oder des QuantiNova Probe RT-PCR Kits, um schnelle und zuverlässige Ergebnisse auf jedem Real-time-Thermocycler zu erhalten.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit enthält einen gebrauchsfertigen 4x Master-Mix, sodass die Reaktions- und Zyklusbedingungen nicht mehr optimiert werden müssen. Geben Sie einfach den RT-Mix, bis zu 800 ng Template-RNA und die Primer-Sonden-Sets zum Master-Mix hinzu und befolgen Sie das Protokoll im Handbuch, um schnelle und zuverlässige Ergebnisse mit jedem Real-time-Thermocycler zu erhalten. Der Referenzfarbstoff ROX wird ebenfalls in einem separaten Röhrchen bereitgestellt, sodass Sie die Konzentration für Ihr jeweiliges Gerät anpassen können. Das Kit bietet außerdem ein einfaches und schnelles Protokoll für die direkte Amplifikation aus Zellkulturen. Die empfohlene Ausgangsmenge reicht von 2000 Zellen bis zu einer einzelnen Zelle, z. B. getrennt durch serielle Verdünnung oder mit dem QIAscout-Gerät. Bei der QuantiNova Internal Control RNA (QN IC RNA) handelt es sich um eine interne Amplifikationskontrolle, die bei Bedarf verwendet werden kann, um eine erfolgreiche reverse Transkription und Amplifikation zu bestätigen. Sie wird bei Verwendung des QuantiNova IC Probe Assays in Form einer internen Kontrolle mit 200 bp im gelben Kanal auf dem Rotor-Gene Q oder im Kanal des VIC/HEX-Farbstoffs auf anderen Real-time-PCR-Geräten detektiert. Alternativ kann sie im roten Kanal des Rotor-Gene Q oder im Kanal des Cy5-Farbstoffs auf anderen Real-time-PCR-Geräten nachgewiesen werden, wenn der QuantiNova IC Probe Assay Red 650 verwendet wird.

Für einen optimierten Workflow empfehlen wir, die QuantiNova-Kits mit unseren vorkonfigurierten QuantiNova Real-time-PCR-Assays oder -Panels zu kombinieren. Diese ermöglichen eine präzise Quantifizierung von mRNA oder langen, nicht-kodierenden RNA-Transkripten unabhängig von ihrer Abundanz. Wählen Sie aus einer breiten Palette an vorkonfigurierten Primer-Sets für Mensch, Maus und Ratte, oder passen Sie Ihre eigenen Assays und Panels mit unseren innovativen Designtools an.
 
Unsere QuantiNova LNA PCR und QuantiNova LNA Probe PCR Assays beruhen auf der LNA-Technologie, die für eine verbesserte Sensitivität sorgt. Das Ergebnis sind unverfälschte Genexpressionsprofile und schneller verfügbare wissenschaftliche Erkenntnisse.

Für den Nachweis auf Basis von SYBR Green bestellen Sie bitte den QuantiNova IC SYBR Green Assay (erhältlich unter der Bezeichnung HS_QIC_2467742 QuantiNova LNA PCR Reference Assay und GeneGlobe-ID: SBH1218551) über unsere GeneGlobe-Plattform.

Hinweis: Der QuantiNova IC SYBR Green Assay war vormals als QuantiTect Primer Assay für den Nachweis von IC-RNA auf SYBR-Basis erhältlich (Kat.-Nr. QT02589307).

QuantiNova SYBR Green und Probe RT-PCR Kits können für die Genexpressionsanalyse von RNA-Zielen auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Dazu gehören der Rotor-Gene Q und Geräte von Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche und Agilent.

Das QuantiNova Multiplex RT-PCR Kit kann für die Multiplex-Genexpressionsanalyse von RNA-Zielen auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Um das Potenzial des Multiplex-Formats voll auszuschöpfen, empfehlen wir die Verwendung eines Geräts mit bis zu 5-Plex-Kapazität, wie z. B. den Rotor-Gene Q.